TriZOL小量法制备RNA.docVIP

Mini-pre Total RNA with TriZOL 幼嫩组织若干，液氮研磨，分装成＜100mg小份至预冷E.P.管 100mg 样品加入1ml TriZOL抽提几分钟（颠倒混匀） 12,000g 、2~8℃离心10min 吸取上清（含RNA），转移至新的1.5ml E.P.管中 15~30℃放置5min 加0.2ml (1/5V TriZOL) 氯仿，充分抽提15 sec. 15-30℃放置2~3min ≤12,000g、2~8℃离心15min 吸取上清，转移至新的1.5ml E.P.管中 加0.5ml (1/2V TriZOL) 异丙醇 15-30℃放置10min ≤12,000g、2~8℃离心10min 小心弃去上清，得胶体状RNA 加1~1.5 ml (≥1V TriZOL) 75%乙醇，涡旋混匀 ≤7,500g、2~8℃离心5min 小心弃去上清，留下胶体状RNA 干燥5~10min 溶于RNase-free水中，枪头打匀，55-60℃温浴10 min 1.5% Agrose胶检测 测定浓度 进一步纯化 所需试剂及用品： 液 氮 氯 仿 异 丙 醇 DEPC 75%乙醇（DEPC处理的水配制） RNase-free水 1.5 ml离心管 1ml、0.2ml、0.1ml、0.01ml枪头各若干 玻璃及塑料制品的处理：（均可用0.5% NaOH浸泡15min，用ddH2O冲洗干净，灭菌备用。） 玻璃器皿：150℃烘烤4 hrs 塑料制品：离心管和枪头用含DEPC的ddH2O浸泡过夜，烘干，灭菌备用。 或者：0.5M NaOH浸泡10min，用ddH2O冲洗干净，灭菌。 RNase-free ddH2O：ddH2O + DEPC过夜（0.01~0.05% V/V），灭菌备用。 仪 器：台式高速冷冻离心机 或者：大型高速冷冻离心机 磨样用具 Note: Always wear disposable gloves. Use sterile, disposable plasticware and automatic pipettes reserved for RNA work to cross-contamination with RNase from shared equipment. Downstream handling of the TriZOL requires that nondisposable glassware or plastic ware be RNase-free. Safety care. 1 Homogenization Phase Separation 此前可于―70℃放置1月再抽提 形成上层无色水相、中间相和下层有机相 中间相和有机相可用于DNA和蛋白质抽提 RNA Precipitation RNA Redissolving RNA Wash 在75%乙醇中，RNA沉淀可于 2~8℃放置1周、―5℃~70℃放置1年 过干会使RNA难以溶解