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IGEM PKU Count Group 分子实验基本操作培训 余涛，郑勤思 2008-4-13 Outline 分子实验基本流程介绍 分子实验基本操作的原理、步骤及注意事项 总结 分子实验基本流程介绍 感受态的制备 PCR克隆目的片断 酶切及酶切片断回收（电泳） 连接 小提质粒并酶切鉴定（电泳） 大肠杆菌的培养 转化 分子实验基本流程介绍 感受态的制备 PCR克隆目的片断 酶切及酶切片断回收（电泳） 转化 连接 小提质粒并酶切鉴定（电泳） 大肠杆菌的培养 分子实验基本操作——大肠杆菌的培养 原理 大肠杆菌在37 ℃下在较好较快的进行增殖， 4 ℃下则可较好停止代谢，便于保存。（长期保存应在-80 ℃ 用15-20%甘油冻存） 由于转入的质粒带有抗性标记，用带有抗生素的培养基即可进行选择性培养。 分为固体培养基培养和液体培养基培养 分子实验基本操作——大肠杆菌的培养 Step0: LB培养基的配制(1L培养基含) 10g Tryptone 5g Yeast Extract 10g NaCl 15g Agar (仅在固体培养基中加入，注意琼脂为Agar琼脂糖/Agarose区分) 1L 去离子水 一般一瓶配100-300mL Step0’: 灭菌（此后一切保持无菌操作） 分子实验基本操作——大肠杆菌的培养 固体培养基培养 （用于筛选或短期保存菌种） Step1: 倒板 微波炉加热培养基 - 室温冷却至60 ℃左右 - 移入超净台，加入抗生素（1000*的，即需稀释1000倍），摇匀 - 趁热快速倒入平板，12mL/板 - 超净台内室温冷却凝固 Step2: 接种 划线法：烧红接种环 - 冷却 - 蘸上菌液 - 在平板上划线 -灼烧接种环。 多用于菌种保存 平铺法：用玻璃刮刀将菌液铺干与平板上，多用于转化 分子实验基本操作——大肠杆菌的培养 固体培养基培养 Step3：37℃培养箱中培养。注意需要先正置10min（防菌液倒流）再倒置培养（防止染杂菌）。注意培养时间不可过长，一般不超过16小时，防止突变株产生。 Step4：培养结束后，需放入4 ℃冰箱的，为防止染杂菌，最好用parafilm封口。 分子实验基本操作——酶切及酶切片断回收 原理： 限制性内切酶： 1）发现于细菌中，用于降解噬菌体的DNA；宿主自身的DNA则被甲基化。 2）分为I、II、III类。常用II类（识别位点与酶切位点一致） 3）区别与外切酶活性（内切酶彻底切断DNA双链，外切酶只切其中一链，往往用于DNA复制的实时检验。） 分类：单切和双切 IGEM PKU Count Group