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酶学及酶工程 Enzymology and Enzyme Engineering 第四章 酶动力学 第一节 酶反应动力学 动力学基本概念和 单底物酶反应动力学 一、酶动力学研究什么？ 酶动力学是对酶催化反应过程的定量研究。 a 酶动力学研究酶催化反应的速度。 b 研究各种因素对反应速度影响的定量规律，包括底物浓度、酶浓度、 pH值、抑制剂和激活剂等，以及其结果和作用机制的关系。 c 研究酶反应中由底物到产物的作用机制历程：以反应速度的定量研究确定底物，产物加入和放出的次序，了解酶和底物的复合物的形成次序，以及它们之间相互转换的过程。 酶动力学研究 酶动力学研究经常是研究工作的启动者： a 方便易行； b 信息有用； c 其它研究的监测手段。 酶动力学研究的特点： a 非直接性。由酶反应量的表现去分析内在机理的理论和方法； b 抽象性。不考虑具体酶反应内容； c 易测量性。需要大量数据，要求较准确测定，要求重复性。 酶动力学方法规律性很强，并不难做。 二、化学反应的级数 0级到3级反应的速度和作用物浓度的关系 0－2级反应的产物公式 速度方程和产物方程 酶反应符合饱和动力学 三、米氏公式－单底物单产物酶反应 推导要点 1. 利用三点设定，由稳态出发。 2. 建立初步关系式后，利用总酶浓度为各个酶浓度之和代入。 3. 推导方向为导出[ES]/[ET]表达式。该表达式即为v/Vm表达式。 4. 适当定义Km。 这是推导酶动力学速度方程时普遍适用的要点。 动力学参数 微观动力学参数：反应过程中每一个具体步骤的正向和逆向速度常数。如本例中的k1, k-1。 宏观动力学参数：反映反应总体情况的动力学常数。如本例中的Km, Vm。 Vm ：最大反应速度。表现催化反应快慢。 Vm = k2[ET], k2又称kcat，比Vm 更反映本质。 Km ：达到最大反应速度一半时的底物浓度。表现底物在酶上结合紧密程度的大小。 米氏常数 Km 以v = Vm/2 代入米氏公式： Vm/2 = Vm [S]/(Km+[S]) Km+[S] = 2[S]，Km = [S] Km值越小，表示达到最大反应速度一半（一半酶被底物结合）所需的底物浓度越低，即底物在酶上亲和力越高。 但Km不是解离常数。解离常数KS=k-1/k1 只有k2k-1时，近似地Km=KS。 kcat Vm的缺点：和酶浓度有关，不是本质上的常数。 kcat = Vm/[E]，消除了[E]的影响。 kcat是一级速度常数，单位为min-1或sec-1，即单位时间里1个酶分子能生成的产物数，即反应次数，又称为turnover number 。 计算kcat时注意Vm和[E]要摩尔化的单位。 由于使用上的方便，目前Vm仍还得到应用。 kcat反映的过程包括 ES ? EP → E+P，所以不是微观动力学常数。 kcat /Km Km和kcat分别体现了酶反应结合步骤和催化步骤的动力学特性。 当[S] Km时，米氏公式简化为： V = Vm[S] / Km = (kcat / Km) [E][S] kcat / Km是酶反应的表观二级速度常数，可以用来衡量酶的催化功能，用做比较酶的催化能力指标。 kcat / Km = kcat k1/(k-1+ kcat) 四、米氏公式的基本作图 1. Lineweaver-Burk Plots（双倒数作图） 由米氏公式两侧同时取倒数，得到： 以1/v vs. 1/[S] 作图为直线。 直线的斜率为Km/Vm，纵轴截距为1/Vm。由此作图的斜率和纵轴截距即可算出Km和Vm。进而可由Vm和酶浓度得到kcat 。 Lineweaver-Burk Plots 2. Hanes-Wolff 作图 在双倒数的公式两侧同乘[S]，得到以下公式： 以[S]/v vs. [S] 作图为直线。 此作图特点为可用等距的[S]。 直线的斜率为1/Vm ，纵轴截距为Km/Vm 。由此作图的斜率和纵轴截距即可算出Km和Vm。 Hanes-Wolff 作图 3. Eadie-Hofstee作图 双倒数公式两侧同乘Vm，得到： Vm/v = 1 + Km / [S] 两侧同乘v: Vm= v + Km v/[S] 移项得到：v = Vm - Km v/[S] 以v vs. v/[S] 作图为直线。 直线的斜率为－Km，纵轴截距为Vm 。由此作图的斜率和纵轴截距直接得出Km和Vm。 Eadie-Hofstee作图 五、单底物酶反应速度方程的一般形式 如果不设定初速度，即需要考虑生成产物的逆反应时，如下式： k1