不能被自身的限制性内切酶识别切割.ppt

基因工程的基本概念 总结 掌握Ⅱ类限制性内切酶的性质、用途、使用方法、影响限制性内切酶活性的因素；掌握DNA连接酶的性质、种类、连接机理；常用的DNA聚合酶、修饰酶、核酸酶的性质及用途。 了解限制-修饰现象；Ⅰ类和Ⅲ类限制性内切酶；限制性内切酶的命名 思考题 什么是细菌的限制-修饰现象？ Ⅱ类限制性内切酶切割产生的末端类型有哪些？粘性末端有何实际意义？ 简述利用Ⅱ类限制性内切酶消化DNA的步骤？ 影响限制性内切酶活性的因素有哪些？ 使用限制酶应该注意哪些问题？ DNA连接酶有哪些性质，哪些种类？ 试述DNA连接酶的连接机理？ 影响DNA连接反应的因素有哪些？ 大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ和Klenow片段各有哪些性质及用途？ 什么是切口平移？ 简述T4 DNA聚合酶的酶活性、特点及用途？ 常用的单链和双链DNA外切酶有哪些？各有什么特点？ RNase H和RNase Ⅰ各有什么用途？ S1核酸内切酶的功能有哪些？ 末端脱氧核苷酸转移酶有哪些特性及功能？ T4多核苷酸激酶有什么功能、用途？ 碱性磷酸酶处理的载体为什么不会自连但能与外源DNA连接？ Bal31 分别用原内切酶切后电泳，判断片断数目和大小。 Hind III EcoR I BamH I Marker ① ?链 有反转录活性和 RNaseH活性。 RNaseH： ?链经过蛋白酶水解后产生的一条多肽。 以5’?3’或3’?5’方向特异地水解RNA-DNA杂交双链中的RNA链。 RNaseH RNA DNA RNA DNA （3）逆转录酶的用途 ② ?链 RNA-DNA杂交双链中5’?3’DNA外切酶活性。 ① 合成cDNA 以oligo dT为引物（与mRNA的polyA尾巴互补结合）。 AAAAA TTTTT 5’ 3’ mRNA 5’ cDNA ② 合成DNA探针 用随机引物（random primer）或oligo dT做引物。 随机引物： 随机顺序形成的寡聚DNA片断。 （理论上它能与各种序列的模板结合） ③ RT-PCR用的模板 克隆某个基因时，用其mRNA反转录出cDNA第一链。 第四节 DNA修饰酶 一、末端脱氧核苷酸转移酶 1. 来源 小牛胸腺。 2. 组成 大小两个亚基。 3. 特性 5’?3’DNA聚合酶活性 （terminal transferase） ② 不需要模板！ ① 需要3’—OH、二甲胂酸缓冲液。 ③ 底物可以是单链DNA、 是3’—OH突出的双链DNA、 平末端在Co2+代替Mg2+下也可以。 ④ 随机添加的dNTPs。 如果只有一种dNTP，就添加上同聚物。 DNA 5’ 3’ TTT dTTP ，末端转移酶 4. 末端转移酶的用途 （1）同聚物加尾 给外源DNA片断和载体分子分别加上互补的同聚物尾巴，以使它们有效地连接。 外源DNA 载体DNA 5’ 3’ 5’ 3’ CCC CCC GGG GGG dGTP dCTP 末端转移酶 （2）再生酶切位点 便于回收克隆片断。 AAGCTT TTCGAA 5’ 5’ HindⅢ酶切 A TTCGA AGCTT A Klenow补平 AAGCT TTCGA AGCTT TCGAA AAGCATTT TTCGA AGCTT TTTTCGAA 末端转移酶 dTTP AAA AAA 外源DNA （3）非放射性标记DNA片断的3’端 AAGCTTTT TTCGA AGCTT TTTTCGAA AAA AAA HindⅢ位点 HindⅢ位点 连接 催化非放射性标记物参入DNA片断的3’端。（生物素-11-dUTP等） 二、T4多核苷酸激酶 1. 来源 T4噬菌体的pseT基因编码。 从T4感染大肠杆菌细胞中分离出来。 多种哺乳动物细胞中也发现这种酶。 2. 功能 催化?磷酸从ATP转给双链或单链DNA或RNA的5’-OH端。 不论5’-OH端突出与否。 5’ 3’ HO- -OH 5’ 3’ HO- -OH 3’ P- -OH 5’ 3’ HO- -P 5’ ATP T4多核苷酸激酶 如果ATP的?磷酸带有32P标记，就会被转移到DNA的5’端。 但天然的DNA的5’端都是磷酸化的。 3. 多核苷酸激酶的用途 DNA 5’-OH端磷酸化、标记DNA的5’端。 5’ 3’ HO- -OH 5’ 3’ HO- -OH 3’ 32P- -OH 5’ 3’ HO- -32P 5’ (?-32P)ATP 多核苷酸激酶 3’ P- -OH 5’ 3’ HO- -P 5’ 碱性磷酸酶 （1）正向反应（forward reaction） （