分子生物学实验一植物基因组DNA提取及琼脂糖凝胶电泳检测.pptVIP

　TAE是使用最广泛的缓冲系统。其特点是超螺旋在其中电泳时更符合实际相对分子质量（TBE中电泳时测出的相对分子质量会大于实际分子质量），且双链线状DNA在其中的迁移率较其他两种缓冲液快约10%，电泳大于13kb的片段时用TAE缓冲液将取得更好的分离效果，此外，回收DNA片段时也易用TAE缓冲系统进行电泳。TAE的缺点是缓冲容量小，长时间电泳（如过夜）不可选用，除非有循环装置使两极的缓冲液得到交换。 　　TBE的特点是缓冲能力强，长时间电泳时可选用TBE，并且当用于电泳小于1kb的片段时分离效果更好。TBE用于琼脂糖凝胶时易造成高电渗作用，并且因与琼脂糖相互作用生成非共价结合的四羟基硼酸盐复合物而使DNA片段的回收率降低，所以不宜在回收电泳中使用。 　　TPE的缓冲能力也较强，但由于磷酸盐易在乙醇沉淀过程中析出，所以也不宜在回收DNA片段的电泳中使用。 * 植物基因组DNA提取及琼脂糖凝胶电泳检测 高级分子生物学实验课一 实验要求 分组实验 仔细观察、认真操作 不大声喧哗 不迟到早退 有事向课代表请假 按时交实验报告 DNA结构 A T G C DNA存在形式 与蛋白质结合在一起以核蛋白（DNP）的形式存在。在制备核酸时通常破坏细胞壁及细胞膜来使核蛋白释放出来 细胞破碎 研磨 膜、组蛋白的分离 CTAB SDS DNA纯化 蛋白变性 去除酚、糖 DNA的沉淀 乙醇 异丙醇 植物DNA提取流程 细胞破碎 ①机械方法： 超声波处理法、研磨法、匀浆法； ②化学试剂法：用SDS处理细胞； ③酶解法： 加入溶菌酶或蜗牛酶，破坏细胞壁。 DNA提取 SDS法 SDS是有效的阴离子去垢剂, 细胞中DNA与蛋白质之间常借静电引力或配位键结合, SDS能够破坏这种价键。 CTAB法 CTAB (hexadecyltrimethylammonium?bromide,十六烷基三甲基溴化铵)，是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜并与核酸形成复合物。该复合物在高盐的溶液中（0.7mol/L?NaCl）可溶。通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后，加入乙醇沉淀（CTAB能溶于乙醇）即可使核酸分离出来。 Tris-HCl (pH8.0)提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏； EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性； NaCl 提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液相中； CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离； β-巯基乙醇（PVP）是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除 CTAB抽提液作用原理 DNA纯化（去杂质） 蛋白质 常用苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）或氯仿：异戊醇（24：1）抽提。 RNA 常选用RNase消化 ，或是用LiCl来消除大分子的RNA。 酚类物质 提取液中加少量巯基乙醇，选取幼嫩的材料。 多糖 提取液中加1％PVP (聚乙烯吡咯烷酮)。 实验材料 杨树叶片 试剂 2×CTAB抽提液 氯仿：异戊醇(24:1) 异丙醇 70%乙醇 材料与试剂 ①微量移液器 ②水浴锅 ③离心机 ④电泳仪及电泳槽 ⑤凝胶成像仪 仪器用具 常见问题 常见问题 DNA分子在高于等电点的PH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。在一定电场强度下，DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数成反比。 电泳原理 琼脂糖是一种线性多糖聚合物。 浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。 琼脂糖浓度(%) 线型DNA分子的分离范围(Kb) 0.3 5～60 0.6 1～20 0.7 0.8～10 0.9 0.5～7 1.2 0.9～6 1.5 0.2～3 12.0 0.1～2 Tris-乙酸（TAE） Tris-硼酸（TBE） Tris-磷酸（TPE） 常用电泳缓冲液 维持合适的pH 具有一定的导电性，以利于DNA分子的迁移 保护DNA不被降解 电泳指示剂溴酚兰在碱性液体中呈紫兰色，一般与蔗糖、甘油或聚蔗糖400组成上样缓冲液。 作用： ①增加样品比重，以确保DNA均匀沉入加样孔内。 ②形成肉眼可见的指示带，预测核酸电泳的速度和位置。 ③使样品呈色，使加样操作更方便。 上样缓冲液 核酸染色剂 溴化乙锭（EB） 是一种荧光染料，EB分子可嵌入核酸双链的碱基对之间，在紫外线激发下，发出红色荧光。其荧光强度与DNA的含量成正比。据此可粗略估计样品DNA浓度。 注意事项： EB是致癌物质，切勿用手接触，更不要污染环境。 其它染料： GeneFinder、Goldview、Genegreen等