毕赤酵母表达步骤.docVIP

毕赤酵母表达系统的构建 1.确定转入的目的基因，并设计相应引物，进行PCR反应，获取目的基因片段。（所需药品-高保真酶，引物，dntp，胶回收试剂盒。） 2.对目的基因及载体Ppic9k进行酶切产生粘性接头并纯化回收。（所需药品- SalI、StuI、SacI【用于于GS115产生His+Mut+】；BglII【用于于GS115产生His+Muts】） 酶切体系 酶切体系 50 (L DNA 10 (L 酶切缓冲液 5 (L 限制性内切酶 1 (L 超纯水 34(L 37 1～4小时酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测分析。连接试剂盒Solution载体DNA 0.5μL 目的片段DNA 4.5μL 连接试剂盒Solution 5 μL 充分混匀，16 ℃连接4 h或4 连接过夜。DH5α扩繁质粒（所需药品- Amp；DH5α；CaCl2） 将DNA目的片段和载体的连接产物与200μL感受态细胞℃热击45-60s，冰浴3min后加入800(L LB 液体培养基37℃震荡培养1h。 （1 ）转化后，将转化混合物涂在含50-100ug/ul Amp 的LB平板上，选择Amp 抗性克隆 （2） 挑取10 个Amp 抗性转化子，接种含150ug/ul Amp 的培养基，37 度振荡培养过夜 （3 ）提取质粒进行PCR及酶切检测并送交测序。（pPIC9k 测序时，用α-factor 引物及3’AOX1 测序引物。将引物重悬于20ul灭菌水中，制成0.1ug/ul 溶液） 4 在0.85ml 过夜培养菌液中加入0.15ml 灭菌甘油，以便保存所需克隆，涡旋混匀转入 标记好的储存管中。在液氮或干冰/酒精浴中冷冻后移入-70 度保存。 5 测序证实结构正确后，可准备转化DNA 5.毕赤酵母电转化： 细胞准备： 毕赤酵母感受态制备： （1）取1 mL GS115过夜培养物(OD6006．0～10．0)转接于100 mL YPD液体培养基中 28℃-3O℃、250—300 r／min培养至酵母菌的对数生长期(OD600 1．0～1．3) （2）取此菌1 mL分装到1．5 mL EP管中，4℃ 、10 000 g离心1 min，弃上清 液，沉淀用无菌水(4℃预冷)洗涤，同样条件下离心，弃上清液。 （3）加入1 mL处理液【10 mM LiAc、10 mMDTI、0．6 M sorbitol、10 mM TrisHC1(pH 7．5)】，室温下放置20 min。离心，弃上清液。 （4）加入1 mL 1 M sorbitol，离心，弃上清液，用1 M sorbitol洗涤二次，到最 终体积约为80微升，冰浴中保存或一70~C保存待用。 转化： 1 取80ul上述细胞与5-20ug线性化DNA（溶于5-10ulTE）混合，转入预冷的0.2cm 电 转杯中。 2 在冰上放置5min 3 根据所使用装置推荐的酿酒酵母参数进行电击 4 立即加入1ml 预冷的1M山梨醇至杯中，将内容物转移至灭菌离心管中 5 分成200-600ul等份，涂于MD 或RDB平板上 6 在30 度孵育平板至克隆产生， 筛选Mut+/Muts表型 6. 遗传霉素抗性转化子 开始前：准备10 个YPD 平板，每个的遗传霉素浓度为0，0.25，0.5，0.75，1.0，1.5， 1.75，2.0，3.0 及4.0mg/ml。 1 吸取1-2ml 灭菌水于所有HIS+转化子平板上 2 用灭菌刮子重悬HIS+转化子，不要划破琼脂 3 将细胞悬液集中转移至灭菌的50ml 离心管中，稍涡旋(5-10S) 4 用分光光度计测定浓度(1OD600=5×107细胞/ml) 注意：混有琼脂会干扰读数 5 在每块含有遗传霉素的YPD 平板上涂105细胞。 (需要证实在没有遗传霉素的YPD 板上细胞的滴度，计算每个遗传霉素抗性平板上抗遗 传霉素克隆的比例，以确定你所得到的多拷贝子是否占平板上转化子的1-10%，将收集的转 化子稀释到10-5，10-6，10-7浓度，每板加100-200ul) 6 在30 度孵育平板，每天检查。抗遗传霉素克隆需2-5 天出现，不含遗传霉素的YPD 平板上克隆需2-3天出现。接下来做结果分析。P39 注意：如果在以上方法里你将所有细胞都悬浮，加15%灭菌甘油，存于-80度，可在以 后时间里做遗传霉素抗性筛选。 7. 筛选Mut+及Muts 转化子 （1）将上一步获得的转化子用灭菌牙签挑取单克隆，在MM及MD 平板上以一定的方式划线或点HIS+转化子，确保先在MM平板上点 （2 ）每个克隆换一次牙签，点100 个转化子后再继续向下做(约2-3 板) （3）为分离Mut+及Muts表型，在MD及MM平板上各点上对照(GS115/HIS+ Muts Ablumin 及GS1