生物药物综合实验---细胞融合实验PPT.ppt

* * * * * * * * * * * * * * * * * * 北京电子科技学院----生物系 生物药物综合实验 王 维 彬 北京电子科技学院----生物系 王 维 彬 实验 九 细胞融合实验 实验目的 实验原理 实验器材 实验方法 实验结果 注意事项 思考题 掌握细胞融合的概念及基本原理。 初步掌握PEG诱导细胞融合的基本原理及细胞融合技术。 了解细胞融合技术的生物学和医学意义。 实验目的 1、PEG是乙二醇的多聚化合物，存在一系列不同分子量的多聚体。PEG可与水分子借氢键结合,在高浓度 (50％)的PEG溶液中自由水消失，导致细胞脱水而发生质膜结构的变化，引起细胞融合。为了发挥PEG促进细胞融合的效力，必须采用较高浓度的PEG溶液，但在高浓度PEG溶液下，细胞可能因脱水而受到显著的破坏。因此，选择合适的分子量、浓度及作用时间是PEG融合技术的关键。 ? 2、细胞融合是用人工的方法使两个或以上的细胞融合成异核细胞。异核细胞可进入有丝分裂，使来自两个亲本细胞的基因组合在一起，形成只含一个细胞核的杂种细胞。 实验原理 ? 3、PEG溶液作为助融剂可改变各类细胞的膜结构，使两细胞接触点处脂类分子发生疏散和重组，引起细胞融合。 4、细胞融合的频率和活力与所用 PEG的分子质量、浓度、作用时间以及细胞的生理状态及密度等有关。本方法用分子质量为400～ 6000的PEG溶液可引起细胞的聚集和粘连，产生高频率的细胞融合。 实验原理 材料：新鲜鸡血 试剂： （1）Alsever液制备 葡萄糖(Glucose)?2.05g? 枸椽酸钠?0.8g? 氯化钠(NaCl)?0.42g? 重蒸水?至100ml? （2）0.85%生理盐水液 （3）GKN液? ? 实验器材 氯化钠?8g? 氯化钾(KCl)?0.4g? Na2HPO4?2H2O?1.77g? NaH2PO4?H2O?0.69g? 葡萄糖?2g? 酚红(phenolred)?0.01g? 溶于1000ml重蒸水中。? （4）50%?PEG液?(现用现配) ?? 根据实验需要，称取适量PEG(Mr.4000)放入刻度离心管内，在酒精灯上将其加热熔化，待冷却至50℃，加入等体积的已预热至50℃的GKN液并充分混匀。? 实验器材 仪器：离心机、显微镜、血球计数器计数等 ? 1.鸡血细胞悬液的制备 （1）．在公鸡翼下静脉抽取2 ml鸡血，加入盛有8 ml的Alsver液中，使血液与Alsver液的比例达1：4，混均后可在冰箱中存放一周。 （2）．取此贮存鸡血1ml加入4ml 0.85%生理盐水，充分混均，800rpm离心3min，弃去上清，重复上述条件离心两次。最后弃去上清，加GKN液4ml，离去。 （3）．弃去上清，加10mlGKN液，制成10%细胞悬液。 （4）．取上述细胞悬液以血球计数器计数，用GKN液将其调整为1×106个/ ml。 （5）．用GKN液将其调整的细胞悬液备用。 实验方法及步骤 2.鸡血细胞的收集 吸取1ml上述鸡血细胞悬液放入离心管中，加入4ml GKN液混匀，1000rpm离心5min。弃去上清液，用手指轻弹离心管底部，使沉淀的血细胞团块松散。 3. PEG诱导细胞融合 吸取0.5ml 39℃的50%PEG溶液，慢慢沿着上述收集沉淀的离心管壁逐滴加入，边加边轻摇离心管，使PEG与细胞混匀，然后在39℃水浴中静置2min。 4.终止PEG作用 缓慢加入5ml GKN液，轻轻吹打混匀，于39℃水浴中静置5min。 6.细胞悬液的制备 用吸管轻轻吹打细胞团数次使细胞团分散，1000rpm离心5min，使细胞完全沉降。弃去上清液，加GKN液，再离心一次，弃多数上清，加0.5ml GKN液，混匀。 实验方法及步骤 取8 ml的Alsver液 加2 ml鸡血 振摇,混合均匀 取1