目的基因的制备幻灯片.pptVIP

以 mRNA减法杂交为例，基本原理是，从表达目的基因的组织中提取mRNA并反转录为cDNA, 然后与无目的基因表达的组织中提取的 mRNA做过量杂交，在两种组织中均表达的基因产物形成 cDNA/mRNA双链杂交分子，而特异mRNA反转录的cDNA片段仍保持单链状态, 将这种单链cDNA分离出来即为 差异表达的序列。 * 第二节 目的基因的分离 * 3.2.2 基因组DNA减法杂交 可以用来分离缺失突变基因。此法的不足之处是只适于具有较大缺失突变体的基因分离。 A 从野生型生物体制备总DNA，用一限制酶切割成小片段。同时从缺失突变生物体制备总DNA，经超声波随机切割之后，用生物素进行标记供作驱使DNA探针。 B 取大大超量的该种探针，与经酶切的野生型总DNA(称为测试DNA)片段混合，经变性、复性处理后，绝大部分的无标记的野生型DNA分子同标记的突变体驱使DNA探针杂交。 * 第二节 目的基因的分离 * C 将杂交反应混合物通过生物素结合蛋白质柱，大部分野生型的DNA分子因与突变型的生物素标记的驱使DNA探针杂交而结合到柱上，而野生型中特定的DNA片段B, 由于在突变型DNA中缺失了相应的片段，故没有相应的标记的探针与之杂交，经洗脱流出。 D 将洗脱收集的DNA同超量的标记探针再次杂交，经过多次重复富集之后，便可克隆到该特异片段。 E 最后用Southern杂交法进一步鉴定，如