实验胰蛋白酶活力的测定.pptVIP

实验六 胰蛋白酶活力的测定 (先打开水浴锅,温度设置成40摄氏度) 一、实验目的 二、实验原理 三、器材仪器和主要试剂 四、实验操作 五、思考题 一、实验目的 掌握定量测定蛋白酶的活性的方法，了解本 实验的酶、底物和生成物的相关性质，以及本反应的环境条件。 进一步理解酶活力和比活力的概念 巩固比色法测定物质含量的基础,掌握721型分光光度计的原理和使用方法,学习绘制标准曲线的方法 二、实验原理 1．胰蛋白酶是一种水解酶，它将酪蛋白水解成酪氨酸等物质。 2．所生成的酪氨酸能与酚试剂反应成蓝色物质.酚试剂又名Folin试剂，是磷钨酸和磷钼酸的混合物，它在碱性条件下极不稳定，可被酚类化合物还原产生蓝色（钼蓝和钨蓝的混合物,680nm） 3．用分光光度计可以定量的比较颜色的深浅，从而推导出酪氨酸的量，根据生成物的含量可以计算胰蛋白酶的活力。 4.蛋白酶活力单位定义：在40?C，pH7.5的条件下，水解酪蛋白每分钟产生1 ?g酪氨酸为1U。 三、器材仪器和主要试剂 721 型分光光度计 Folin 试剂甲液，乙液 0.5% 酪蛋白 100 μ g/mL Tyr 溶液  四、实验操作 1、酪氨酸标准曲线的制作 2、蛋白酶活力的测定 胰酶活力单位定义： 规定在 40 ℃ ， pH7.5 的条件下，水解酪蛋白每分钟产生酪氨酸 1 微克为一个酶活力单位。1g 蛋白酶在 37 ℃ ， pH7.5 的条件下所具备的总活力单位为： （ A 样 — A 对 ）× K × V/t × N A 样 ：样品液光吸收值； A 对 ：对照液光吸收值； K ：标准曲线上光吸收为 1 时的酪氨酸微克数； t ：酶促反应的时间（分），本实验 t =10 ； V ：酶促反应管的总体积（毫升数），本实验 V =6 ； N ：本次实验酶液的稀释倍数:2000 五、思考题 酶的试验为何设对照又要设空白 稀释的酶溶液是否可长期使用？说明原因。 如何保证本实验测定数据的准确性？ * * 以酪氨酸浓度μg/ml数为横坐标， A680nm为纵坐标，作出标准曲线。 迅速混合，于40℃放置15分钟 1 1 1 1 1 1 酚试剂(ml) 5 100 0 1.0 6 5 80 0.2 0.8 5 调0 A680nm 5 5 5 5 Na2CO3(ml) 60 40 20 0 稀释后Ty（μg/ml） 0.4 0.6 0.8 1.0 水（ml) 0.6 0.4 0.2 0 Tyr 100?g/ml(ml) 样品 4 3 2 1 管号 2 ------ 3 ---- 1 2号(对照) ------- 3 ---- 2 1 1号(样品) 40℃水浴保温10分钟，过滤得滤液 酪蛋白（ml） 三氯 醋酸（ml） 40℃水浴准确保温10分钟 三氯 醋酸（ml） 酪蛋白（ml） 酶液（ml） 管号