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创新性实验：中药对肝脏的保护作用 实验目的要求 学习查阅与研究内容相关的文献资料。 结合完成的基础性实验和综合性实验，学习自行设计实验方案。 学习撰写实验论文 实验背景 在传统的中药中有许多补肝保肝的单方与复方，但是，对它们的作用机理研究却明显不足，在正常生理状态下，细胞中的成分和维持正常生理活动的酶活性相对稳定。但是，在细胞受到损害或者不同的生理条件下，细胞中的成分会发生变化。 利用动物肝损伤模型，采用细胞学的实验技术，测定肝细胞中相关指标的变化，为探讨相关中药的作用及其机理提供基础实验数据。 文献查阅 常用文献查阅的网站和搜索方法。 Pubmed:美国国立医学图书馆期刊文献 Sciencedirect: 万方数据： 清华同方CNKI-中国期刊全文数据库 重庆维普科技期刊全文数据库 Pubmed/pubmed Pubmed/pubmed Pubmed/pubmed Pubmed/pubmed Pubmed/sites/entrez?db=pubmed Pubmed使用教程 复旦大学网站关于Pubmed使用方法的详细讲解： 27/jiaoyanshi/dzjc/flash/pubmed/3.htm Sciencedirect： / Sciencedirect： / 中文电子资源： 中文电子资源： 中文电子资源： 中文电子资源： 万方数据： 万方数据： 万方数据： 万方数据：Adobe Acrobat Reader 实验技术路线： 实验对象：益肝灵 益肝灵具有抗肝毒作用，对四氯化碳、半乳糖、硫化乙酰胺、乙醇等引起的肝损伤，可以通过稳定感细胞膜的作用而保护肝细胞及改善肝脏功能，具有降低血清谷丙氨基转移酶的作用。 实验技术路线： 四氯化碳肝损伤动物模型的制备： (1)取昆明种小鼠60只，随机分成空白对照组、四氯化碳模型组、益肝灵药物处理组3个剂量组以及阳性对照组，每组10只。. 益肝灵药物处理组每天灌胃(ig)给药1次，四氯化碳组和空白对照组以等容积自来水灌胃，1 d，于末次给药后1 h，除空白对照组外，其余各组均腹腔注射0．1％四氯化碳油容液10 ml／kg，空白对照组则腹腔注射等量花生油 24 h后测定指标，取肝脏匀浆，按照试剂盒操作说明检测肝脏匀浆总谷胱甘肽、GSSG和GSH含量。 反应原理 GSH和GSSG检测试剂盒可以分别检测出GSH和GSSG含量的检测试剂盒。 通过谷胱甘肽还原酶把GSSG还原成GSH，而GSH可以和生色底物DTNB反应产生黄色的TNB和GSSG。适当配制反应体系，前后两个反应合并起来，总谷胱甘肽（GSSG+GSH）就相当于一个颜色产生的限速因素，总谷胱甘肽的量就决定了黄色的TNB形成量。从而通过测定412nm光吸收值就可以计算出总谷胱甘肽的量。 用适当试剂先清除样品中的GSH，然后利用上述反应原理就可以测出GSSG的含量，用总谷胱甘肽（ GSSG+GSH ）的量扣除GSSG的含量，就可以计算出GSH的含量。 反应原理： 试剂盒清单 总谷胱甘肽检测缓冲液 60ml 谷胱甘肽还原酶 12微升 氧化型谷胱甘肽(GSSG) 5mg DTNB 4.5mg 蛋白去除试剂M 1g NADPH 4mg DMSO 1.5ml GSH清除辅助液 0.8ml GSH清除试剂 160微升 说明书1份 试剂的配制 GSSG储备液的配制：将试剂盒中5mgGSSG中加入816微升纯水溶解并混匀，即得到浓度10mM的备用液，分装-20℃保存。 DTNB储备液的配制：将试剂盒中4.5mgDTNB溶解于1.5mlDMSO，即得备用液，分装-20 ℃保存。 蛋白去除试剂M溶液的配制：称取0.2g蛋白去除试剂M，加入4ml总谷胱甘肽检测缓冲液，配制成5%的溶液，该试剂必须新鲜配置，当天使用。 NADPH储备液的配制：将4mgNADPH假如100微升纯水，溶解混匀，分装后-70 ℃保存。 试剂的配制 40倍稀释谷胱甘肽还原酶的配制：取1微升谷胱甘肽还原酶，假如39微升总谷胱甘肽检测缓冲液，混匀。 总谷胱甘肽检测工作液的配制：根据待检样品数参考下表配制适当量的总谷胱甘肽检测工作液，三种试剂按照比例混合，即为总谷胱甘肽检测工作液。 试剂的配制 0.16mg/mlNADPH的配制：取2微升NADPH储备液，加入500微升总谷胱甘肽检测缓冲液，混匀即为0.16mg/mlNADPH，每检测1个样品需50微升该液体。 稀释的GSH清除辅助液的配制：在47微升的纯水中加入53微升GSH清除辅助液，立即混匀。稀释后的清除辅助液不稳定，需新鲜配制，当天使用。 GSH清除试剂工作液的配制：10.8微升GSH清除试剂中加入89.2微升无水乙醇，立即混匀。新鲜配制，当天使用。 标准品的准备 把10mMGSSG储备