[临床医学]2012基因重组.ppt

重组DNA与基因工程 广州医学院实验医学研究中心 几个重要的专业名词 重组DNA技术（recombinant DNA technique），在体外通过末端共价连接重新组合脱氧核糖核酸（DNA）分子，使它们能在适当的细胞中增殖的遗传操作。 这种操作可把特定的基因组合到载体上，并使之在受体细胞中增殖和表达。 遗传工程(Genetic engineering )就是按人们的意思去改造生物的遗传特性、或创建具有新遗传物性的生物。 遗传工程广义包括细胞水平上的遗传操作（细胞工程）和分子水平上的操作，即重组DNA技术（有人称之为基因工程） 基因工程中最主要的工作是分子克隆（molecular cloning ） 重组DNA技术流程 一般包括四个步骤 ①产生DNA片段（目的基因的获得）； ②DNA片段与载体DNA分子相连接； ③将重组DNA分子导入宿主细胞； ④选出含有所需要的重组体DNA分子的宿主细胞。 基因重组所必需的元素及过程 1 目的基因 2 载体 3 工具酶 4 宿主细胞 载体分类 按功能 ①克隆载体（目的基因拷贝 ）； ②表达载体 （基因表达产物 ） 按宿主细胞 ①原核载体；②真核载体；③穿梭载体（携带两种宿主复制子，能在两种生物体内复制。） 常用的载体有质粒、噬菌体和病毒载体 ①质粒（plasmid）细菌细胞基因组外的共价闭合环状双链DNA分子，能自主复制，能与细菌共生的遗传成分。 ②噬菌体（phage）感染细菌的一类病毒，有的基因组较大，例如λ噬菌和T等；有的则较小，如M13、f1、fd等。 ③动物病毒（virus）质粒和噬菌体载体只能在细菌中繁殖，不能满足真核DNA重组需要。 　①比15kb小质粒比较容易分离纯化，＞15kb的大质粒则不易提取。 ②能自主复制，只有ori能被宿主细胞复制蛋白质识别的质粒才能在该种细胞中复制 。 ③质粒对宿主生存并不是必需的 。 质粒载体的优缺点 ⑴优点——易操作，用途广 ⑵缺点——容量小，化学法的转化率低 ⒉噬菌体载体 双链DNA，滚环复制。 溶源性（温和phage ）——感染细菌后，整和到细菌染色体 溶菌性（烈性phage ）——感染后大量复制，细菌死亡破裂。 感染 溶源 条件诱导 溶菌 用作克隆载体的噬菌体 λ噬菌体和M13噬菌体 噬菌体载体的优缺点 ⑴优点——容量大，转染频率高，筛选方便 ⑵缺点——操作困难（需体外包装，CsCl2超速离心），保存困难（滴度下降） ⒊病毒载体 病毒载体构建时一般都把细菌质粒复制起始序列放置其中，使载体及其携带的外来序列能方便地在细菌中繁殖，然后再引入真核细胞。目前病毒载体常用的有改造来自猴肾病毒SV40（Simian Virus 40）、逆转录病毒和昆虫杆状病毒等，其目的为将目的基因或序列导入动物细胞中表达进行功能研究、或用作基因治疗等。 三、工具酶 一般分四类： ①核酸酶（切割和裂解） ②连接酶 ③聚合酶 ④修饰酶 1.核酸酶 核酸酶可分为两类： 核酸外切酶（exonuclease）是从核酸的一端开始，一个接一个把核苷酸水解下来； 核酸内切酶(endonuclease)则从核酸链中间水解3’，5’磷酸二酯键，将核酸链切断。 分类： 按限制酶的组成、与修饰酶活性关系，切断核酸的情况不同，分为三类： Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ Ⅰ类限制性核酸内切酶　由3种不同亚基构成，兼有修饰酶活性，随机切割在识别位点1000bp以外的DNA序列。 Ⅱ类限制性核酸内切酶　只由一条肽链构成，切割DNA特异性最强，在识别位点范围内切断DNA。通常在重组DNA技术使用的限制性核酸内切酶 Ⅱ型酶的特点 识别序列特异 ； 切割方式特异 ⑴识别序列 4-6碱基对，识别序列往往是旋转对称，迴文结构的双链DNA 5’…G↓AATT C …3’ 3’…C TTAA↑G… 5’ ⑵切割方式 平末端和粘末端 ⑶同裂酶 识别位点相同，切割位点不同或相同 ⑷同尾酶 来源不同，识别序列不同，但产生的粘性末端相同 星活性（star activity） ——非最适条件下酶的识别特异性降低，产生非特异的切割现象。 引起Star活性的原因 1. 较高的甘油浓度 (5% v/v)。 2. 酶与底物DNA比例过高 (不同的酶情况不同，通常为100