[农学]基因操作的基本技术.ppt

欢迎同学们听课！ 欢迎研究生听课！ 本课程内容 第一章 绪论 第二章 基因克隆的工具酶 第三章 基因工程的载体 第四章 目的基因的制备 第五章 目的基因导入和重组子的筛选 第六章 外源基因的表达 第七章 基因操作的基本技术 第八章 植物基因工程及应用 第九章 动物基因工程及应用 第十章 医学基因工程及应用 第七章 基因操作的基本技术 7.1 DNA制备技术 p25 7.2 DNA凝胶电泳技术 p68 7.3 PCR技术 p54; p195 7.4 分子杂交技术 p297 7.5 探针标记技术 p306 7.6 DNA测序技术 p326 7.1 DNA制备技术 7.1.1 DNA的来源 7.1.2 DNA制备基本步骤 7.1.3 DNA制备基本方法 7.1.1 DNA的来源 染色体DNA 病毒（噬菌体）DNA 质粒DNA 线粒体和叶绿体DNA 7.1.2 DNA制备基本步骤 准备材料 裂解细胞 分离、提取DNA 纯化、浓缩 7.1.3 DNA制备基本方法 细菌质粒DNA的制备方法 CTAB法 细菌质粒DNA的提取 1）碱裂解法: 细菌染色体DNA和质粒DNA在碱性条件下均会发生变性，由于质粒DNA分子比染色体DNA的分子小得多，所以当溶液的pH成为中性时，质粒DNA容易复性，染色体DNA由于结构复杂、分子量大故不能复性，而与细胞碎片、变性蛋白、多糖等形成复合物一同沉淀。 2）热变性法: 原理与碱裂解法类似，其变性手段为加热变性。但该法缺点为多糖污染较多。 3）两法在变性与复性步骤均需操作温和，以免染色体DNA断裂成为与质粒DNA分子大小差不多的片段分子，从而导致染色体DNA污染。 CTAB法 基本原理: 表面活性剂（hexadecyltrimethylammonium bromide, CTAB ）可使膜蛋白、核蛋白变性，DNA释放到溶液中。在高盐（1M NaCl）条件下， DNA 与CTAB结合溶于水中，当溶液中盐浓度降低时（0.5M NaCl），DNA与CTAB复合物会沉淀下来。 该法获得的DNA纯度较高，多糖物质污染较少。但产率可能较低。 在加入液氮研磨样品至加入抽提液抽提DNA这段时间内的操作宜迅速，防止解冻后细胞内释放的DNase降解DNA。 7.2 凝胶电泳技术 7.2.1 凝胶电泳技术的原理 7.2.2 凝胶电泳的类型 7.2.3 琼脂糖凝胶电泳及其参数 7.2.4 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 7.2.5 脉冲电场凝胶电泳 7.2.1 凝胶电泳技术的原理 DNA在中性或偏碱性的条件下带负电，在电泳过程中处于负极的DNA通过凝胶分子筛向正极移动。迁移速度受电场强度、所带电荷数量及分子大小、构型等因素的影响，与DNA分子中的碱基组成和顺序无关。 电泳结束后，用溴化乙锭（ethidium bromide，EB）染色，可观察到DNA在凝胶中所处位置。 7.2.2 凝胶电泳的类型 琼脂糖凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳 脉冲场凝胶电泳 7.2.3 琼脂糖凝胶电泳及其参数 琼脂糖：从海藻中提取的线性多聚体大分子。在沸水中溶解，40°C左右开始凝固，其单体分子互相交联，形成立体网状结构，其孔径大小取决于琼脂糖的浓度。 琼脂糖凝胶电泳参数： 1，电泳缓冲液 2，琼脂糖的浓度 3，DNA样品 4，电泳条件 5，EB染色和紫外观察 琼脂糖凝胶电泳的用途 DNA片段大小的估算 分子量测定 回收目标片段 浓度测定：～10ng 7.2.4 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE) 聚丙烯酰胺凝胶是丙烯酰胺（Acr, acrylamide）单体在甲叉双丙烯酰胺（Bis, N,N’-methlene bisacrylamide）交联剂作用下形成的一种交联网状结构 分辨率高达1bp，用于DNA序列测定 载样量大 回收纯度高 7.2.5 脉冲电场凝胶电泳(contour-clamped homogenous electric field, CHEF/pulsed field el