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液相色谱应用案例（二） 廖杰 liaojie301@163.com 液相色谱应用案例 在药物研究开发中的应用 质量研究 药物代谢 在生物标志物研究与分析中的应用 DHPLC与基因诊断 体液中氨基酸分析 体液中儿茶酚胺的测定 其它应用 蛋白质组研究中的色谱预分离 20年抗放药物研究的基本情况 ——————————————————————— 研 究 项 目 数量(X) (X x 100)/7000 x% ——————————————————————————— 在小鼠上试验过的化合物 7000 100.0 对小鼠有抗放作用的化合物 230 3.3 在狗上试验过的化合物 70 1.0 对狗有效的化合物 30 0.43 能上人进行研究的化合物 14 0.2 临床上进行扩大研究的药物 4 0.057 ——————————————————————— 建立HPLC分析方法——确定应用目的 纯度检查/质量控制（鉴别/有关物质检查/含量测定）/代谢研究 分离对象——原料/制剂/体液/组织 定量分析/定性分析 常量/痕量 主成分/相关杂质 常规质控/实验室研究 建立HPLC分析方法——了解中间体和副产物 建立HPLC分析方法 ——动物体内代谢的研究 选择内标化合物 预处理方法的确定 建立色谱分离和检测方法 分析方法的确证与实施 主要代谢产物的鉴定 血浆药物浓度测定方法——方法的确证 方法的专属性——内源性物质、代谢产物不干扰分离 线性——…… 定量限——…… 日内和日间精密度——三个浓度（…… ） 准确度 稳定性——血浆室温放置24hr、-20℃和室温反复冻融 Capillary or nano LC Pump Injector SCX Column Salt gradient Collected fractions Loading Pump Injector 1 or 2 Enrichment Columns Waste NanoLC Pump Nanobore Column Ion Trap analysis 1990’s 2000 Future GeneDiscovery DiscoveryofVariations Variation Linkageto Disease DiagnosticsandPharmacogenetics DHPLC与基因诊断 Substitutions ACCGTCAAC...GCGACCT TGGCAGTTG…CGCTGGT ACCGTCCAC...GCGACCT TGGCAGGTG…CGCTGGT Transversion: exchange of a purine for a pyrimidine A - C Purine - Pyrimidine Insertions 5’ACCGTCAACGACCT3’ 3’TGGCAGTTGCTGGT5’ TCGGAT AGCCTA 5’ACCGTTCGGATCAACGACCT3’ 3’TGGCAAGCCTAGTTGCTGGT5’ Deletions 5’ACCGTCAAC...GCGACCT3’ 3’TGGCAGTTG…CGCTGGT5’ 5’ACCGTCAACGACCT3’ 3’TGGCAGTTGCTGGT5’ C…G G…C DHPLC分离原理 DHPLC的分离模式 Non denaturing: 50 ?C (Size Dependent, Sequence Independent) High-Resolution dsDNA Fragment Separations bp 587 458 434 298 257+267 174 102 80 * * 药物研究开发过程中的液相色谱 靶标鉴定/确认 生物标志物的分离/鉴定 药物发现 药物开发 临床研究 生产销售 药物设计/合成/鉴定 /筛选/毒性评价 确定候选药物 原料和制剂的临床前研究 药学/药理毒理 纯化/鉴定 代谢组学研究 确证结构/质量研究/制定质量标准/稳定性研究/动物体内药代 申报 检验疗效和毒性 质量控制 疗效/毒性长期研究 人体药代/长期稳定性研究/