[医药]2基因工程制药1.pptVIP

第二章 基因工程制药 基因工程是将一种生物的基因分离出来，在体外进行酶切和连接插入载体构成遗传物质的新组合，导入另一种宿主细胞使目的基团得到复制和表达的技术。 基因工程可生产的主要药物是指医用活性蛋白和多肽，包括免疫性蛋白、细胞因子、激素、酶等。 2.1 基因工程药物生产的过程 2.2 目的基因的获得 2.3 基因的表达 2.4 基因工程菌生长代谢的特点 2.5 基因工程菌的稳定性 2.6 基因工程菌的发酵 2.7 基因工程药物的分离纯化 2.8 包含体的复性 2.9 基因工程药物的质量控制 2.1 基因工程药物生产的过程 2.2 目的基因的获得 一、构建基因文库 二、构建cDNA文库 三、 PCR方式 先决条件：已知目的基因的DNA序列。 原核：以基因组为模板 反转录PCR（RT-PCR）：提取mRNA，反转录生成cDNA作为模板进行PCR扩增获得目的基因。 四、化学合成 已知基因或蛋白质全长序列，合成短的寡核苷酸片断，拼接为长的DNA片断，再用连接酶连接成完整基因。 2.3 基因表达 基因表达：结构基因在生物体中的转录、翻译及所有的加工过程。 一、宿主细胞的选择 首要条件：能够生产出有活性的目的产物。 其他条件：容易获得较高浓度的细胞； 产物的产量、产率高； 能利用易得廉价原料； 不致病、不产生内毒素； 容易进行DNA重组技术操作； 产物容易提取纯化。 表达系统的分类： 1、原核表达体系 （1）大肠杆菌：目前采用最多的原核表达体系。 革兰氏阴性菌 优势： 遗传背景清楚，基因组序列已确定； 生长迅速，平均20~30min繁殖一代； 易于培养，生产成本低，适合大规模培养； 外源基因表达水平高，可达总蛋白的5~30％以上； 有大量可供选择利用的克隆和高效表达载体。 缺点： 缺乏翻译后加工修饰系统，缺少糖基化功能； 没有有效释放蛋白到培养基中的分泌机制； 表达的外源蛋白多形成包涵体，蛋白的复性较困难 ； 翻译目的蛋白N端常多一个甲硫氨酸残基（AUG编码）。 （2）枯草芽孢杆菌 革兰氏阳性菌，其基因组测序已经完成。 胞外分泌能力强； 有很多可用的质粒载体； 无糖基化功能； 具有很强的胞外蛋白酶活性，对目的产物有不同程度降解。 （3）链霉菌 优点： 对人畜基本无致病性； 已发展了一大批有实用价值的载体质粒； 链霉菌的模式菌株天蓝色链霉菌的基因组测序已完成； 具有很强的外分泌能力； 表达蛋白基本能正确折叠，不形成包含体； 具有糖基化功能 为重要的工业微生物，下游培养工艺成熟。 缺点： 对其分子生物学研究不深入； 对外源基因表达的影响因素，特别是分泌机理还需系统研究。 2、真核表达系统 （1）酵母 单细胞生物，无毒，易培养，繁殖快。 具有分泌功能，能够糖基化。 以往多采用酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）作为表达系统，近年来采用毕赤酵母（Pichia pastoris）表达蛋白增多。 毕赤酵母转录外源基因的启动子来自于毕赤酵母醇氧化酶I（AOX1）的启动子，受甲醇的严格调控，可使外源基因高效表达。 毕赤酵母的特点： 为真核表达体系，可进行翻译后修饰； 表达量高，明胶的表达量可达14.8g/L; 比其他的真核表达体系培养成本低，只需要含盐的简单培养基； 适于高密度培养，菌体干重可达100g/L以上。 杂蛋白较少，产物纯化容易。 为了最大限度的稳定毕赤酵母表达菌的稳定性，已构建