WB操作说明-碧云天.doc

中文|English 窗体底端 试 剂 质粒抽提|DNA纯化胶回收 基因组DNA抽提|DNA电泳 DNA分子量标准|感受态制备 T载体、质粒|基因突变 DNA连接|DNA标记和检测 内切酶|修饰酶 PCR相关|RNA相关|其他 蛋白定量|裂解及蛋白抽提 蛋白电泳|蛋白分子量标准 一抗|二抗|Western 免疫沉淀|免疫染色 细胞凋亡坏死|细胞增殖 细胞培养|细胞组织染色 细胞转染|细胞组分分离 EMSA相关|报告基因相关 一氧化氮相关|活性氧相关 抑制剂激活剂等|荧光探针 其他试剂盒|常用试剂 仪 器 摇床|涡旋混合器 紫外分析仪|真空泵|离心机 天平|移液器|定时器 其他仪器 耗 材 离心管|离心瓶|PCR耗材 冻存管|枪头|移液管 巴氏吸管|离心管盒、冻存盒 PCR管盒|冰盒|离心管架 枪头盒|培养皿|培养板 手套等防护用品 载玻片|盖玻片|存储盒 染色缸染色架|其他染色耗材 印迹膜、胶片、暗盒等 滤纸、滤膜、滤器|蓝盖瓶 其他实验耗材 免费订货电话:800-8283301 手机用户请拨打:0513电话订货时间:周一至周五9:00-17:00 电子邮件订货:order@ 传真订货:0513订单下载:碧云天订单.xls 订货须知 ?????????????????????????????Western实验步骤 ????Western，也称Western blot、Western blotting、Western印迹，是用抗体检测蛋白的重要方法之一。Western可以参考如下步骤进行操作。 1. 收集蛋白样品(Protein sample preparation) ????可以使用适当的裂解液，例如碧云天生产的Western及IP细胞裂解液(P0013)、RIPA裂解液等，裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。对于某些特定的亚细胞组份蛋白，例如细胞核蛋白、细胞浆蛋白、线粒体蛋白等，可以参考相关文献提取这些亚细胞组份蛋白，也可以使用试剂盒进行抽提，例如碧云天生产的细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒(P0028)。 ????收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。如果使用碧云天生产的Western及IP细胞裂解液或RIPA裂解液，可以使用BCA蛋白浓度测定试剂盒(P0009/P0010/P0010S/P0011/P0012/P0012S)。 2. 电泳(Electrophoresis) (1) SDS凝胶配制 ????SDS凝胶可以参考一些文献资料进行配制，也可以使用碧云天生产的SDS凝胶配制试剂盒(P0012A)。该试剂盒提供了除水和配胶器具外的所有试剂以及配制各种浓度SDS的配方。 (2) 样品处理 ????在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS蛋白上样缓冲液。例如2X或5X的SDS蛋白上样缓冲液。使用5X的SDS蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。5X的SDS蛋白上样缓冲液可以参考相关文献资料配制，也可以使用碧云天生产的SDS蛋白上样缓冲液(5X)(P0015)。 ????100℃或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白。 (3) 上样与电泳 ????冷却到室温后，把蛋白样品直接上样到SDS胶加样孔内即可。 ????为了便于观察电泳效果和转膜效果，以及判断蛋白分子量大小，最好使用预染蛋白质分子量标准(P0066)。 ????电泳时电泳液可以使用碧云天生产的SDS电泳液(P0014A/P0014B)。 ????电泳时通常推荐在上层胶时使用低电压恒压电泳，而在溴酚蓝进入下层胶时使用高电压恒压电泳。对于Bio-Rad的标准电泳装置或类似电泳装置，低电压可以设置在80-100V，高电压可以设置在120V左右。SDS可以采用普通的电泳仪就可以满足要求，也可以采用碧云天的多功能电泳仪(带定时)(EEP102)。为了电泳方便起见，也可以采用整个SDS过程恒压的方式，通常把电压设置在100V，然后设定定时时间为90－120分钟。设置定时可以避免经常发生的电泳过头。????通常电泳时溴酚蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳，或者可以根据预染蛋白质分子量标准的电泳情况，预计目的蛋白已经被适当分离后即可停止电泳。3. 转膜(Transfer) ????我们推荐在Western实验中选用PVDF膜(FFP30/FFP33)。硝酸纤维素膜(NC膜)(FFN06/FFN09)也可以使用，但硝酸纤维素膜比较脆，在操作过程中特别是用镊子夹取等过程中容易裂开。