冰冻切片实用技术.pptVIP

* * 神经生物学研究室 王特为 自 我 简 介 王特为 医学博士 副教授 硕士生导师 Tel:E-mail: wtw72@163.com 冰冻切片（frozen sections） 是将活组织迅速冰冻、切片、染色，进行病理诊断的方法。最常用于： ① 快速病理诊断。 ② 显示组织中的脂质。 ③ 在组织化学上显示酶活性。 ④ 神经组织学的镀银和镀金染色法。 ⑤ 免疫荧光的研究。 冰冻切片病理诊断的准确性较石蜡切片差，不能作为常规诊断方法。 （一）优点： 1．简便，可以不需要对组织固定、脱水、透明、包埋等手续即可进行切片，减少了一些中间环节。 2．快速，用时短。 3．组织变化不大。 4．能很好保存脂肪，类脂等成分。 5．能够比较完好地保存各种抗原活性及酶类，特别是对于那些对有机溶剂或热的温度耐受能力较差的细胞膜表面抗原和水解酶保存较好。 （二）缺 点 1．不容易做连续切片。 2．切取的组织不能过大，组织过大不容易冻结或者组织冻结不均，影响切片及染色效果。 3．不容易制作较薄的切片。 4．组织块在冻结过程中容易产生水的结晶而影响细胞的形态结构及抗原物质的定位，并且组织结构也不如石蜡切片清晰。 （一）主要应用：? 1．用于某些水解酶的定位的组织化学方法以及免疫组织化学方法等。 2．用于证明脂肪及类脂和神经组织髓鞘的染色时的切片。 3．用于临床手术的快速病理诊断。 （1）新鲜的组织制备 ? 组织尽可能新鲜、骤冷愈快愈好，才能避免冰晶 常用的骤冷剂有： ①液氮（－190℃） ②液氮冷却的丙烷（－19℃）。液氮适用于组织化学，较安全。缺点：组织块易发生龟裂。 ③CO2气（干冰 －78℃） ④丙酮干冰冷却的轻石油醚、乙烷和庚烷（－80℃） ?为防止水解酶和其他物质的移位、弥散，常用4℃、24小时的甲醛固定能很好地保存酶类。但对许多脱氢酶和转移酶能灭活，故不宜使用。但低温，冷甲醛短时间固定（10分钟左右），可显示琥珀酸脱氢酶。 电镜出现后，需要保存细胞的超微结构，以4％缓冲戊二醛（25%戊二醛16ml；0.1M二甲胂酸（pH7.0．）84ml；蔗糖8g）固定较好。这些固定液主要用于水解酶，而不适于许多氧化还原酶和转移酶。 ?一般在冷冻后10分钟，到接近冷室温度时再切，一般组织在－15～－20℃切片最易成功。每种组织有其合适的切片温度、刀的温度和冷室温度，Pearse及Bancroft的经验如下： 组织 刀温度 组织温度 恒冷箱温度 肝 -18 -10 -5 肾 -15 -8 -5 皮肤 -35 -10 -5 脑 -18 -5 -5 固定组织一般高3-5度 （4）抗卷板 ?抗卷板的前缘与刀面须有足够的距离，使切片平滑通过。抗卷板略高于刀面的最高点。可凭经验调整刀对组织的角度，一般新刀为20℃ （5）切片机 ?操作程序：先接通电源，调定恒冷箱温度，调整切片刀的角度，调定切片厚度，标本置载台致冷达所需温度后，将其安放在切片机推进器上。即可切片。 恒冷箱视使用情况每周或每月清洁一次冰霜。 （6）切片刀 新刀切片满意，旧刀用自动磨刀机磨刀较好。如果切片刀与抗卷板的位置，角度合乎要求，又有一把锐利的刀，就能获得理想的切片。 ①取材 未能固定的组织取材，不能太大太厚，厚者冰冻费时，大者难以切完整，最好为24×24×2mm。 ②取出组织支承器，放平摆好组织，周边滴上包埋剂，速放于冷冻台上，冰冻。小组织的应先取一支承器，滴上包埋剂让其冷冻，形成一个小台后，再放上细小组织，滴上包埋剂。 ③将冷冻好的组织块，夹紧于切片机持承器上，启动粗进退键，转动旋钮，将组织修平。 ④调好欲切的厚度，根据不同的组织而定，原则上是细胞密集的薄切，纤维多细胞稀的可稍为厚切，一般在5～10um间。 ⑤调好防卷板。制作冰冻切片，关键在于防卷板的调节上，这就要求操作者要细心，准确地将其调好，调校至适当的位置。切片时，切出的切片能在第一时间顺利地通过刀防卷板间的通道，平整地躺在持刀器的铁板上。这时便可掀起防卷板，取一载玻片，将其附贴上即可。 ⑥应视不同的组织选择不同的冷冻度。冷冻箱中冷冻度的高低，主要根