噬菌体展示技术..pptVIP

什么是噬菌体展示 　　是一项筛选技术，将外源多肽或蛋白与噬菌体的衣壳蛋白融合表达，融合蛋白展示在病毒颗粒的表面，而编码该融合子的DNA则位于病毒粒子内。　 表型————基因型 展示肽————编码基因 Landmarks of phage display 1985 第一次发表噬菌体展示技术；展示多肽 Smith GP. Science.1985; 228:1315-7 1988 噬菌质粒系统 1990 抗体片段的展示 1993 展示cDNA文库 1994/1995 研发了‘phage two-hybrid’技术 1996 首次体内in vivo 淘选试验 1998 噬菌体展示载体作为基因导入载体 1999 Combination of phage display with high-density arrays 2001 Automated phage display selection Killing cancer cells by targeted drug-carrying phage nanomedicines Published: 3 April 2008 BMC Biotechnology 2008, 8:37 doi:10.1186/1472-6750-8-37 展示系统　Display System 噬菌体展示系统的分类 根据噬菌体不同Phage M13, f1, fdT7, T4, lamda 根据载体不同Vector True Phage Phagemid 根据文库不同Library 随机肽库、cDNA文库、抗体文库、蛋白质文库 M13噬菌体的组成和结构 丝状噬菌体：M13、f1和fd。?? 单链DNA病毒,6407 bp。?? 基因组编码11种蛋白质，其中5种为结构蛋白质。??与展示密切相关的有两种结构蛋白质。 DNA在细菌内滚环复制，细菌不被裂解，但生长速度减慢，并且分泌大量噬菌体颗粒 Life Cycle of M13 pIII蛋白结合于E.Coli 的F纤毛;?? 病毒ssDNA进入细菌的胞浆合成dsDNA；?? 以dsDNA为模版合成所有的病毒蛋白，且通过滚环复制合成组装病毒所需的ssDNA。 第一代噬菌体在感染10分钟后出现在培养液中（37℃）。?? 感染后1小时内平均每个细胞分泌1000个噬菌体。 次要衣壳蛋白pIII 406 aa 组成，5个拷贝，位于噬菌体的尾部。 ??由三个功能区组成： ????N1 穿膜区：作用于E.coli细胞膜上的TolA蛋白；与噬菌体的入侵有关。 ????N2 受体结合区：负责结合F菌毛。 ????CT 疏水区：组装前黏附在细菌内膜上；与噬菌体组装终止有关。 ????G1、G2:甘氨酸片段，在感染过程中，增加各个功能域之间的灵活性。 主要衣壳蛋白pVIII ??每个病毒子含约2700个拷贝，约10%能有效地融合外源多肽或蛋白。以pIII融合子方式表达的多肽是低价的，而以pVIII融合子方式表达的多肽则是高价的（每个病毒子~200个拷贝）。 ??这种高价pVIII展示所增加的亲和力有利于筛选到亲和力非常低的配体，而低价pIII展示则将筛选限制在具有较高亲和力的配体上。 ??所有Ph.D.文库都是pIII融合方式（每个病毒子展示5个拷贝的外源多肽）。 pIII蛋白展示和pVIII蛋白展示有什么不同? pVIII 展示的多肽比较小，如果太大会影响噬菌体壳蛋白的组装。 pIII只要不影响感染，可以展示300 aa的多肽。 噬菌质粒能展示的蛋白已经达到86 kDa。 丝状噬菌体展示系统一般是在包膜蛋白pIII或pVIII的N端融合外源多肽。 每个病毒子含５个拷贝的pIII蛋白，这五个蛋白都可以融合短肽而不影响噬菌体的感染力。 拷贝数不同。 噬菌体质粒－方便克隆、增强遗传稳定性 噬菌体展示技术流程 亲和淘选 噬菌体肽库与靶分子相互作用 洗涤去未结合的或非特异性结合的噬菌体 将特异性结合的噬菌体洗脱下来 三轮淘选后，克隆测序 噬菌体展示的应用 抗原表位分析 ?制备特异性抗体 ?制备疫苗、多价疫苗 ?构建新型的生物催化剂 如Renet al (1997)将T4 DNA连接酶展示于T4噬菌体，所表达的融合蛋白能够高效连接黏性或者平末端。 有可能把催化某一代谢途径的多种酶展示到噬菌体上，制造人工的多酶复合体。或者把成百上千个酶分子的活性位点展示到同一个噬菌体颗粒上，制造superenzyme。 筛选酶抑制剂是寻找抑制酶活性肽段的理想工具。Dennis从肽库中筛选到非竞争性地抑制F VIIa 活性的肽段。 噬菌体展示的应用 蛋白质－蛋白质相互作用 噬菌体cD