阿维菌素试验方案培养基斜面和分离培养基g／L可溶性淀粉10.PDFVIP

中国试剂网 3.10.2.3 阿维菌素试验方案 培养基 （1）斜面和分离培养基(g ／L) ：可溶性淀粉10，(NH4)2SO4 2 ．5，NaC1 0 ．6， MgSO ·7H2O 1 ．2 ，K2HPO4·3H2O 3 ．0，CaCO3 3 ．0，琼脂粉 20 ，pH 7 ．2～ 7 ．4 ，用蒸馏水配制。 种子培养基(g ／L) ：玉米淀粉25 ，花生饼粉1O，黄豆饼粉8．0，酵母粉5 ．0， 酵母膏5 ．0，玉米浆4 ．0，CoCl2·6H2O 0 ．003，淀粉酶0 ．0025，pH7 ．O～7 ．2 ．用 自来水配制。 发酵培养基(g ／L) ：玉米淀粉7O，花生饼粉1O，黄豆饼粉8．0，酵母粉5 ．0， 酵母膏3 ．0，玉米浆2 ．2 ，CoCl2·6H2O 0 ．003，淀粉酶0 ．0025，pH7 ．O～7 ．2 ．用 自来水配制。 （2 ）见笔记本 培养方法 从平板上挑取灰色丰满的单菌落，转接于斜面，28 ℃培养7～9 d ．待长出丰富的 灰色孢子后，转接于种子培养液，220 r ／min ，28 ℃摇床培养28～30 h，接种5 ％于发酵培养液(250 ml 三角瓶，装50ml 发酵液) ，220 r ／min ，28 ℃摇床培养7～ 9 d，放瓶测定各指标。 3 ．诱导子制备 （1）藻多糖提取工艺 nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;取海藻置于托盘放入恒温培养箱低温烘干，用电磨机 打碎，使之成粉末状。用天平称取海藻粉50g 放入500ml 锥形瓶中加蒸馏水250ml 放置于95℃水浴锅中，并隔10min 晃一次，4h 后取出，冷却到室温。离心取上 清液，在离心管中加无水乙醇，得到沉淀再次离心，取沉淀(多糖) ，用蒸馏水冲 洗数遍，于37 度烘箱中烘干所得沉淀为粗多糖。 （2 ）1 多糖提取工艺紫菜一粉碎一紫菜干粉(40 目)(加水(40-50 倍)一微波加热浸 提-粗滤-离心(4000r/min,10min )-浓缩-45℃真空千燥一紫莱多糖（微波功率200w ， 加热时间8min，水与紫菜液固重量比为50:1 ） 2 多糖含量的分析方法还原糖的测定:采用3.5 一二硝基水杨酸比色法[51.总糖含 量的测定:采用苯酚一硫酸比色法，以葡萄糖为标准品 中国试剂网 3.10.2.3 3 紫菜多糖的计算多糖含量(%)=0.9x(总糖百分含量一还原糖百分含量)X100% ， 其中 0.9 是多糖的换算系数;紫菜多糖提取率(%)=紫菜多糖的含量/紫菜原料的质 量x 100%. （3 ）将用来制备诱导子的6 种微生物分别接种到相应的液体培养基中进行摇床 振荡培养．其中，粗糙脉孢菌、紫红曲霉在马铃薯葡萄糖液体培养基中 25 ℃培 养7 d ；掷孢酵母、深红酵母在麦芽汁液体培养基中25 ℃培养3 d ；N89 在营养 肉汤培养基中28 ℃ 培养5 d；A05 在蛋白胨查氏液体培养基中28 ℃ 培养10 d、 分别收集培养好的菌体细胞，按Ayers 方法来制备诱导子．取2 g(湿重) 的菌体 细胞，用蒸馏水、100 mmol ／L 和500 mmol ／L(pH 7 ．2) 的PBS 缓冲液分别洗 涤2 次，超声破碎细胞，离心收集沉淀，沉淀再用500 mmol ／L(pH 7 ．2) 的PBS 缓冲液和蒸馏水分别离心(4 000 r ／min ，5 min)洗涤8 次，并重悬于蒸馏水中，0 1 MPa 灭菌20 min 后，置一20 ℃ 下储存备。 4. 效价测定 （1）层析法分离纯化，HPLC 法测定效价(任超，马珦玻.阿维菌素 B1a 组分高 产菌株诱变育种。生物技术通报，2005 ，4) 取发酵液5 ml，3 000 r ／min ，离心10 min，弃上清。加入丙酮2 ml ，在旋涡式 混合器上振荡1 min，静置10 min，重复3 次。加入乙酸乙酯3 ml，振荡1 min， 3 000 r ／min ，离心10 min，上清液备用。 吸取4Oμl 上清液点样于GF254 硅胶板上，然后层析。展层剂为：乙酸乙酯：三 氯甲烷：二氯甲烷：无水: 甲醇=9 ：9 ：2 ：1。层析后在紫外灯下观察，将斑点处