鸡大肠杆菌的分离鉴定及药敏试验.DOCVIP

鸡大肠杆菌的分离鉴定及药敏实验 随着养鸡业集约化、产业化的不断发展，疾病越来越多，细菌对抗生素的耐药性越来越强，在临床疾病防治工作中，要取得较好的治疗效果，需要选择对致病菌比较敏感的药物来进行预防和治疗，达到有效控制疾病的目的。为了控制鸡大肠杆菌在鸡群中的传播，我们对送检的疑似大肠杆菌病例进行病原的分离鉴定，并对分离菌的培养特性、致病力及抗菌药物的敏感性进行了研究，为有效防制鸡大肠杆菌病提供了依据。 关键词：大肠杆茵； 分离鉴定； 药敏 1 材料 1.1病料来源 采自 鸡场150～200日龄有典型气囊炎、肝包膜炎、心包膜炎和败血症的病死蛋鸡的肝脏、脾脏、心血等。 1.2 培养基 普通琼脂培养基与普通肉汤培养基[LB培养基：固体：胰蛋白胨1.0g加入酵母提取物0.5g、NaCl0.5g，、琼脂粉1.5g使其充分溶解，高压灭菌20min，铺板并保存于4℃”。液体：胰蛋白胨1.0g加入0.5g酵母提取物、0.5g NaCl，然后定容至100ml，高压灭菌20min，4℃保存] 麦康凯琼脂培养基 水解酪蛋白（MH）培养基 三糖铁琼脂（蛋白胨20g，牛肉浸膏5g，乳糖10g，蔗糖10g，葡萄糖1g，NaCL5g，硫代硫酸钠0.2g，硫酸亚铁0.2g，琼脂粉20g，加热溶解后PH调至7.4加入0.4%酚红水溶液6.3ml蒸馏水定容1000ml，分装4-5ml灭菌，制成底层较深的斜面） 胰蛋白胨水溶液（蛋白胨2.5g，NaCL 1.25g，蒸馏水250ml，PH调至7.6，分装灭菌） 葡萄糖蛋白胨水溶液（100mlpH7.6的邓亨氏蛋白胨水中加葡萄糖1g，溶解后分装1ml每管，灭菌） 1.3 仪器与器材 超净工作台，天平、接种环，平皿，试管，灭菌锅、恒温培养箱、显微镜、离心机、细菌微量生化反应器、pH计 、旋涡混合振荡器 96孔板 、灭菌试管、容量瓶、刻度吸管、接种环、移液器和吸头等 生化发酵管（葡萄糖、麦芽糖、甘露醇、乳糖、尿素分解管、硫化氢、枸橼酸盐、赖氨酸、苯丙氨酸、鸟氨酸、半固体琼脂、蛋白胨水、木糖、葡萄糖磷酸盐、山梨醇等） 1.4 药物与试剂 琼脂，肉汤，麦康凯琼脂，95%酒精、甲基红、α萘酚酒精、氢氧化钾、结晶紫、草酸铵、碘化钾、碘片、复红、MH肉汤、MH琼脂 M-R试剂（用95%酒精60ml溶解0.02g甲基红，定容100ml） V-P试剂（甲：5%α萘酚酒精溶液；乙：40%氢氧化钾水溶液，装于棕色瓶，4℃保存） 草酸铵结晶紫染液（A液：结晶紫2g研细后加入95%酒精20ml使之溶解；B液：草酸铵1g溶于100ml蒸馏水，两液混合） 革兰氏碘液（2g碘化钾溶解于少量水中，加入1g碘片使之完全溶解，定容300ml） 复红染液（2.5ml复红加100ml酒精，取混合液10ml加80ml蒸馏水） 2. 大肠杆菌的分离鉴定 2.1大肠杆菌的分离培养 无菌采集病、死鸡的肝脏、心血等组织，划线接种于普通琼脂平板、麦康凯琼脂平板及普通肉汤，37℃培养18～24h，挑取可疑菌落接种在麦康凯琼脂平板/普通琼脂上，37℃培养18～24 h；再挑取粉红色单个菌落再接种在麦康凯琼脂平板/普通琼脂上分区划线，37℃培养18～24h。连续纯培养3代，得到纯培养物。 2.2 细菌形态学观察 挑取表面光滑，边缘整齐，灰白色半透明的单个小菌落划线接种于麦康凯琼脂平板或伊红美兰琼脂平板，于37℃培养20h，观察结果。 2.3 革兰氏染色 用接种环挑取一环生理盐水放于玻片上，再挑少量纯培养物与玻片上生理盐水混合，并均匀涂布玻片上，自然干燥后滴加草酸铵结晶紫染液，1-3min后水洗；加革兰氏碘液媒染1min，水洗；加95%酒精脱色15-30S，水洗；加分红复染1min，水洗，自然干燥后镜检。观察细菌染色与形态特征。 2.4 生化试验 挑取麦康凯琼脂上长出的红色菌落接种于生化试验微量发酵管中，37℃培养24-48h，并记录试验结果。 2.4.1三糖铁琼脂(TST)接种 用接种针挑取单个菌落，划线接种于培养管中（自下到上S型划线），再将接种针垂直插入半固体培养基中央，穿刺到培养基底部，然后沿原穿刺线退出接种针，37℃培养24h，换茬结果。 2.4.2糖（甘、醇）类发酵试验 挑取纯培养物接种于微量发酵管中，倒置37℃培养24-48h，观察结果。若能分解此种糖类产酸，指示剂显酸性变化，发酵管种颜色发生变化，不分解此种糖类无颜色变化，产气可使倒置小管内产生气泡。 2.4.3吲哚试验 挑取纯培养物接种于蛋白胨水培养基，37℃培养3-5d。先加少量乙醚，要懂事管以萃取和浓缩吲哚使其浮于培养基表面，再沿关闭加入欧-波二氏试剂数滴，接触面橙红色的为阳性反应。 2.4.4 M-R试验 挑取纯培养物接种于葡萄糖蛋白胨水培养基，37℃培养3-5d，加甲基红2滴立即观察结