土壤中产淀粉酶菌株的分离与鉴定及高活力淀粉酶的筛选资料.doc

土壤中产淀粉酶菌株的分离、纯化与鉴定及高活力淀粉酶菌株的筛选 组数：第一组 组员：王臣东 李长花 张晓晶 杨明明 1 实验目的 1.1掌握土壤中分离产淀粉酶菌株的方法。 1.2进一步掌握和熟练无菌操作技术。 1.3掌握分离纯化微生物的方法。 1.4掌握从环境中采集样品并从中分离纯化某种微生物的完整操作步骤。巩固以前学的微生物学实验技术。学习淀粉酶活性的测定方法。α-淀粉酶是一种液化型淀粉酶，它的产生菌芽孢杆菌，广泛分布于自然界，尤其是在含有淀粉类物质的土壤等样品中。分离得到纯种这只是选种工作的第一步。所分得的纯种是否具有生产上所要求的性能，还必须要进行性能测定后才能决定取舍。性能测定的方法分初筛和复筛两种。初筛一般在培养皿上根据选择性的原理进行。例如要测定淀粉酶的活力可以把斜面上各个菌株一一点种在含有淀粉的培养基表面，经过培养后测定透明圈与菌落直径的比值大小来衡量淀粉酶活力的高低。复筛是在初筛的基础上做比较精细的测定。一般是将微生物培养在三角瓶中作摇瓶培养，然后对培养液进行分析测定。在摇瓶培养中，微生物得到充分的空气，在培养液中分布均匀，因此和发酵罐的条件比较接近，这样，测得的结果更具有实际的意义。 95%乙醇 3.4.3 2%淀粉溶液：2克淀粉加入少量热水使其溶解，再加入热水至100ml 4 实验步骤 4.1 培养基的制备及其仪器的灭菌 4.1.1按培养基配方比例依次准确地称取牛肉膏、蛋白胨、NaCl放入烧杯中。加少量水熔解,再加入琼脂加热溶化最后补充水分，分装入试管内或三角烧瓶内，加塞包扎。 4.1.2 试管中加入4.5ml水，三角瓶中加入玻璃珠和90ml水，将所有待灭菌仪器和培养基用报纸包扎，121℃， 20分钟高压蒸汽灭菌。 4.1.3搁置斜面及倒平板 将灭菌的培养基冷至50℃左右，在超净工作台上，试管棉塞端搁在玻棒上，搁置的斜面长度以不超过试管总长的一半为宜。三角瓶中的培养基倒平板，静置待用。 4.2 产淀粉酶菌株的分离、纯化 4.2. 1采集土壤样本 由于甘肃张掖昆仑生化公司有生产淀粉的车间，所以在其周围有大量产淀粉酶的菌株，然后用小铲子去除5cm表土，取离地面5-15cm处的土样10-25g，盛于预先灭菌的牛皮纸袋中扎紧，标明时间、地点和环境情况，放在冰箱中保存。 4.2.2 稀释 称取土样10g，放入盛有90ml无菌水并带有玻璃珠的三角瓶中，至于摇床摇15min，使土样和水充分混合，使细胞分散。用一只无菌吸管吸取0.5ml土壤悬浮液加入盛有4.5ml含有无菌水的试管中充分混匀，此为10-1稀释液，依此稀释10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7 几种稀释度的土壤溶液。 4.2.3 初步筛选 4.2.3.1用稀释样品的同吸管分别依次从10-10-6、10-5、10-4样品稀释液中，吸取mL于冷却凝固的平板上，用涂布棒涂抹均匀。倒置于37℃温箱中培养小时培养小时后，取出平板，注入碘液，因淀粉遇碘变蓝色，如菌落周围有圈，说明该菌能。从平板上选取淀粉水解圈直径与菌落直径之比较大的菌，用接种环沾取少量进行2-3次划线分离挑取单菌落至斜面上，培养后 4.2.6.2初染：在做好的涂面上滴加草酸铵结晶紫染液，染1分钟，倾去染液，流水冲洗至无紫色。 4.2.6.3媒染：先用新配的碘液冲去残水，而后用其覆盖涂面1分钟，后水洗。 4.2.6.4脱色：除去残水后，滴加95%酒精进行脱色约15－20秒，后立即用流水冲洗。 4.2.6.5复染：滴加番红染色液，染3－5分钟，水洗后用吸水纸吸干。 4.2.6.6镜检：油镜观察染色结果。 4.3 高活力淀粉酶菌株的筛选： 4.3.1初筛（点样接种法） 4.3.1.1 将上步平板上淀粉水解圈直径与菌落直径之比较大的菌温箱中培养小时淀粉水解圈直径与菌落直径 mL，装量20 mL，培养温度37℃，摇床转速120 r / min，培养24h。 4.3.2.3 培养好的液体4000 r / min离心20min,取上清液0.2 mL 与1 mL 质量分数1％的淀粉溶液于37 ℃水浴5 min，然后沸水浴5 min，终止反应，再加入1 ml碘液，沸水浴5 min后，迅速冷却观察颜色。以空白液体培养基加质量分数1％淀粉直接煮沸再加1 ml碘液，反应后作为空白对照。 5 注意事项： 5.1 液体培养基做好后应该立即灭菌，防止空气或别的杂菌污染培养基。 5.2 在琼脂溶化的过程中，需不断搅拌。 5.3 沸水浴后要迅速冷却。 5.4 分装过程中注意不要使培养基沾在管口或瓶口上，以免沾污棉塞而引起污染。 固体分装分装试管，其装量不超过管高的1/5，灭菌后制成斜面，分装三角烧瓶的量以不超过三角烧瓶容积的一半为宜5.5 搁置的斜