菌种保藏冷冻干燥管的制备幻灯片.pptVIP

菌种保藏冷冻干燥管的制备 河北科技大学生物科学与工程学院 河北省发酵工程技术研究中心 徐亲民 * 水分在冰冻状态下直接升华而干燥 冷冻干燥的三要素： 真空——降低水的蒸汽压以加速水分的蒸发 冷冻——使水蒸气冷凝以减轻真空泵负荷,加速干燥 温度——达到进一步加速干燥的目的 冷冻干燥的优点： 对微生物的生物活性影响小 所得干粉疏松，溶解性好 水分含量低 由于同时满足干燥和真空两个菌保要素,因而保存时间长,保存过程不易失活和退化 冷冻干燥原理 * 取质地均匀、厚实(壁厚1 mm)、无毛点、无气泡的硬质玻璃专用菌种冷冻管（图1），清洗干净后在管内放置打印有菌种简略名称和编号的纸条标签（图1左边的单管式冷冻管置于熔封区和装液区之间，右边的套管式冷冻管置于内外管之间），单管式冷冻管管口和套管式冷冻管内管管口插入缠绕松弛的棉签，用牛皮纸包裹，于121℃灭菌30分钟，取出置37℃孵育24小时，重复灭菌一次，105~110℃烤干（有硅胶指示剂的要使硅胶达到深蓝色），置干燥器内备用。 冷冻管的准备 * 图1 用于冷冻干燥菌种的两种冷冻干燥管 推荐尺寸：(左) Φ8×100，璧厚1 mm，球径12 mm；(中、右)外管Φ12×100，璧厚0.8-1 mm；内管Φ9×50，壁厚0.5 mm。 棉塞 熔封区 放标签处 装液区 外管 熔封区 棉塞 内管 放标签处 变色硅胶 棉塞 * 取市售新鲜、清洁、无抗生素污染的牛奶200 g，在5000 r/min下离心10分钟，除去上层奶皮，如此重复两次。然后分装入两个250 ml锥形瓶中，加棉塞并用牛皮纸包头、扎牢，在110℃下灭菌15分钟，冷却后备用。如灭菌后放置时间超过24小时，则应弃用。也可以购买袋装或盒装的超高温灭菌优质脱脂牛奶直接使用，无需再灭菌。或将脱脂奶粉制成还原乳，同上灭菌后使用。 脱脂牛奶的准备 * 选生长饱满且无菌检查合格的新鲜菌种斜面或米孢子，加入适量灭菌脱脂牛奶(一般每支中试管斜面加10 ml脱脂牛奶，或每10 ml脱脂牛奶中加1 g米孢子粒)，用自制接种耳(图2)将斜面上的菌苔轻轻刮下(注意不要刮坏琼脂表面)，或在强力振荡器上将米孢子粒上的孢子震落，摇匀，用灭菌吸管或长针注射器吸出牛奶菌悬液，置于预先灭菌的空试管内。以上操作应在无菌室内的超净工作台上进行。 菌悬液的制备 * 图2 自制接种耳和长嘴毛滴管 不锈钢丝 木柄 玻璃毛滴管 橡皮头 * 将牛奶菌悬液用长针注射器或长嘴毛滴管(图2)分装入灭菌冷冻管内(注意不要使牛奶玷污纸条标签)，视冷冻管的大小每只0.3~0.5 ml (单管式冷冻管球形装液区内的装液量应为球体积的一半左右，套管式冷冻管内管的装液高度与管直径相当)，取出棉签棒，留置棉花，置于冷冻干燥机内冷冻干燥24小时左右。冷冻干燥机要先开机预冷30分钟以上再开泵。根据设备情况，有的在冷冻干燥前还要先用液氮或干冰对菌悬液进行预冻。另外，要根据冷冻干燥机的水分蒸发能力，确定一次放入的冷冻管数量。 冷冻干燥 * 确认菌悬液是否已经干燥的方法是一看真空度，二看冷冻室温度。当水分已经蒸发完，即水蒸汽分压接近零时，真空度将达到最高值而不再上升；由于蒸发是一个吸热过程，在整个冷冻干燥过程中冷冻室的温度将会维持很低，使菌悬液一直处于冻结状态，当没有水分的继续蒸发后，冷冻室不再吸热，温度开始自然上升。确认干燥后，要先开启冷冻室的进气阀，让真空释放，然后停泵，打开冷冻室，将冷冻干燥管取出。为了确保冷冻干燥管内的菌粉不被污染，在冷冻室进气口应装有空气过滤器。 干燥的确认和停机 * 用自制简易冷冻干燥机进行冷冻干燥管的冷冻干燥，效果优于外购冷冻干燥机。制作方法如下：自制两只1升左右的不锈钢缸子，一只作为真空冷冻干燥室，另一只作为冷凝室，在两个缸子的齐口处焊接宽边不锈钢圈，上面有一只能连接真空泵的加厚透明有机玻璃盖(便于观察内部)，用硅橡胶圈使缸子与缸盖密封。另外买一只2~3升的不锈钢真空保温桶，作为液氮罐(最好是专用液氮罐) ，其口径应能使上述缸子坐入保温桶，而钢圈架在桶沿上 (图3和图4)。 简易冷冻干燥机的制作 * 图3 自制简易冷冻干燥机(方案一) 至真空泵 真空保温桶(液氮罐) 液氮 冷冻真空室 (放冷冻干燥管) 硅橡胶密封圈 进气阀 冷凝室 厚壁软管 真空表 * 图4 自制简易冷冻干燥机(方案二) 至真空泵 真空保温桶(液氮罐) 液氮 冷冻真空室 (放冷冻干燥管) 硅橡胶密封圈 进气阀 冷凝室 真空表 注：冷冻真空室夏天由室温加热，冬天可在外壁缠绕加热带，控温30~40℃。 * 操作前，将冷冻干燥室和冷凝室清洗干净，控干后用酒