蛋白质晶体学课程课件幻灯片.ppt

使用Denzo一般分三步. 第一步自动指标化，得到晶体的格子类型，晶胞参数，晶体取向参数，X射线位置座标等信息。如果显示的预测点和实际衍射点基本一致，则自动指标化过程正常。并输出14种格子和晶胞参数变形表，晶体取向参数等信息。选取最高对称性而又有最小变形的格子，作为你的晶体可能的格子类型。 第二步用Fit命令修正有关的参数。一般先修正晶体取向参数，晶胞参数和射线位置参数，并从中等分辨率逐渐向高分辨率扩展。注意有些参数是高度相关的，不要同时修正，除非你有高质量高分辨率的数据。当某些参数不再需要修正时，也可固定这些参数，修正其它参数。 第三步调节镶嵌度和点的形状和大小，以求得衍射点的积分强度。如果实际衍射点多于预测点则增加镶嵌度值，反之则减小。预测点的形状和大小是否与实际点吻合，可通过Image Window窗口考察，并改变椭球长短轴的值使两者更好的吻合。 执行Denzo程序输出一个文件叫“.x”，它含有一些参数及衍射点指标hkl，强度I等13项信息。修正结果好的话κ2值应接近1或在2以下。当你第一幅画面处理完後，可用批处理方式处理所有其它画面。得到一系列的“.x”文件，供Scalepack程序用。 Scalepack 的说明 由于数据收集过程中晶体衍射能力有衰减，不同方位时晶体对射线的吸收情况也不同，以及射线强度的涨落等因素，所以对称性联系起来的等效衍射点，它们之间的强度并不相等。因此，要选择一幅画面作为参考，计算每一幅画面的比例因子k和B因子，用k因子B因子校正後，把Denzo输出的所有“.x”文件中的等效点进行平均和合并；并用全部数据对晶胞参数，晶体取向，镶嵌度进行更精确的修正。最後给出一套完整的数据文件“.sca” 及对数据的统计分析。Scalepack不仅可以比例合并从一个晶体来的衍射数据，也可有其它的应用。用于重原子衍生物的搜寻，即收集几幅衍生物的画面与母体数据相比，以检验是否是一个有用的衍生物；多套母体数据的合并；对某些空间群与另一套数据合并时的重新指标化；完整的两套数据比较；反常散射信息的探测；高分辨率数据和低分辨率数据的合并。决定晶体所属的空间群。 4.4.5数据质量评价 完整度（completeness）:80%以上，分壳层完整度随分辨率降低 丰度（redundancy）：2－3倍以上 Rmerge:总体3-11% 分壳层的R随分辨率而升高，但最高壳层不应超过25％为好 4.5相角测定 多对同晶置换法 分子置换法 多波长反常散射法 直接法 4.5.1多对同晶置换法 多对同晶置换法基本原理 Fp＋Fh＝Fph |Fp|、|Fph|可从实验得到。设法解得Fh＝|Fh|exp(iαh)有了|Fp|、|Fph|、|Fh|及αh理论上可以得到二个 Fp的解，如果有两个以上的重原子衍生物，即有|Fph1|、|Fph2|就有可能得唯一的Fp了。这就是多对同晶置换原理的基本思想。 一般步骤：1用浸泡法制备重原子衍生物 2收集母体和重原子衍生物的衍射数据 3确定重原子位置 4修正重原子参数 5计算相角及电子密度图 4.5.1.1重原子衍生物制备 基本上靠运气和经验。可以从蛋白质分子的氨基酸组成来考虑。自由巯基常是Hg试剂的结合位点，His也常是重原子的配体，Met中S常和Pt试剂结合，镧系锕系的金属离子与Glu，Asp 重原子衍生物鉴定 同晶度好 强度变化明显且衍射强度的平均变化不随分辨率提高而增加，结合位点少而每个结合位点占有率高 4.5.1.2确定重原子位置 由于大分子和小分子的明显差别，不能用小分子的传统Patterson法测定大分子中重原子的位置。一般要用各种差值 Patterson，衍生物和母体蛋白的强度差。想象为只有重原子在蛋白质分子晶胞内。 为了求差一定得把两套强度数据统一在同一水平上才能相减 同晶差值Patterson法 (⊿Fiso)2=(kFPH - FP)2≈FH2Cos2(αPH -αH) 反常差值Patterson法 (⊿Fano)2=(FPH(+) - FP(-))2≈FH2Sin2(αPH-αH) 优点是同一晶体的数据与比例因子无关，缺点是反常差一般比同晶差小，要求强度测量更精确 加和差值Patterson法 (⊿Fiso)2 + (⊿Fano)2≈FH2 这两者的加和近似一常数。同晶差贡献小的衍射点则反常差贡献就大。两者结合比单独使用任一种函数要好。 联合差值（Matthews加和） |FH|2=|FP|2+|FPH|2–2|FP|×|FPH|{1-[(f’/f’’)( FPH(+) - FPH(-))/2|FP|]}1/2 4.5.1.3共同原点 由于各衍生物在确定重原子位置时所取的坐标原点不同，它们