蛋白质免疫印迹技术幻灯片.ppt

六、思考题 　1. 影响制备特异性强、效价高的抗血清的因素有哪些？ 　2. 如何保存抗血清？ 3. 如何检测抗血清？原理是什么？ * 免疫应答产物：指免疫球蛋白和各种淋巴因子。 抗原刺激机体产生免疫应答的规律：如抗原的识别和递呈、免疫细胞间的信息传递和作用、基因调控等。 * 也就是说，不是任何物质都有抗原性，也不是凡有抗原性的物质对任何机体都能引起免疫反应。即使同一抗原作用于不同的动物、或者是同种动物的不同个体，所引起的免疫反应可能也是不同的。 * 抗原就是指能刺激机体的免疫活性细胞产生抗体，并在体内外发生特异性反应的物质。 免疫原性：是指抗原对有反应能力的个体引起免疫反应的能力。有没有免疫原性取决于两个因素：一是抗原分子表面有没有特定的化学结构；二是生物机体有没有相应的免疫活性细胞（或抗体）。 * 抗原与相应抗体在浓度合适时，则形成清晰的沉淀环，其直径大小与所加抗原量成正比。将已知参考抗原形成的沉淀 环绘成曲线，然后以待测标本的沉淀 环直径查标准曲线，计算出待测抗原的含量。 * 在琼脂糖凝胶中，在一定的pH和离子强度下，可溶性的抗原和抗体在介质中相向扩散，至相对应性抗原与抗体适合比例时，则可出现免疫沉淀线，再根据沉淀 线的种类及特点，鉴别抗原或抗体的性质异同。 （六）免疫方法 抗原剂量，首次剂量为10～50μg，加强免疫的剂量约为首次剂量的1/4。 首次免疫时抗原与完全佐剂等体积混合。加强免疫时用不完全佐剂。 每2～3周加强免疫一次。 在第2次加强免疫后2周，从耳缘静脉取2～3mL血，制备血清，检测抗体效价。如未达到预期效价，需再进行加强免疫，直到满意时为止。当抗体效价达到预期水平时，即可放血制备抗血清。 抗体的产生顺序与丰度 （七）抗血清的采集与保存 取兔血有两种方法，一是耳缘静脉或耳动脉放血，一是颈动脉放血，也可心脏采血。 小鼠取血。 收集的血液置于室温下1h左右，凝固后，置4℃下，过夜（切勿冰冻）析出血清，离心，4000rpm,10min。在无菌条件，吸出血清，分装（0.05～0.2mL），贮于-80℃以下冰箱，或冻干后贮存于4℃冰箱保存。 （八）抗血清质量的评价 在免疫期间，不仅各个不同的动物，而且同一动物在不同的时间内抗血清效价、特异性、亲合力等都可能发生变化，因而必须经常地采血测试。只有在对抗血清的效价、特异性、亲合力等方面作彻底的评价后，才可使用所取得的抗血清。 效价?　抗血清的效价，就是指血清中所含抗体的浓度或含量。效价测定的方法常用的是单向扩散免疫法，此法对所有的抗体均适用。 某些由大分子（如蛋白类）抗原所产生的抗体，可用双扩散等方法测定。 单向扩射免疫法：?以不同稀释度的抗血清与优质标记抗原混合，孵育24h后，测定其结合率。通常以结合率为50%的血清稀度和为效价。 如某抗血清的结合率为50%时的稀释度为1：15000,则该血清的效价就是1：15000 制备含有一定浓度抗血清的琼脂凝胶板（抗体固定不变）。打孔，加入不同稀释度的抗原量，进行免疫扩散。抗原与相应抗体在浓度合适时，则形成清晰的沉淀环，其直径大小与所加抗原量成正比。将已知参考抗原形成的沉淀环绘成曲线，然后以待测标本的沉淀环直径查标准曲线，计算出待测抗原的含量。 双向扩散法：利用大分子抗原和抗体在琼脂平板上扩散，两者在相交处产生沉淀线，以观察和判断抗血清中是否有抗体及其浓度。 双向免疫扩散 免疫扩散试验 1－抗原；2－7为不同稀释倍数的抗体 分 子 杂 交 原 理 及 流 程 图 样 品 制 备 电 泳 杂 交 转 膜 结果显示 探 针 制 备 第二部分 Western－blotting 检测抗血清 Western Blot原理 将通过PAGE分离的蛋白质转移到NC膜或PVDF膜上； 然后与能特异性识别待检蛋白的抗体进行反应； 洗涤去除没有结合的特异性抗体后； 加入标记的、能识别特异性抗体的种属特异性抗体，反应一段时间后再次洗涤去除非特异性结合的标记抗体； 加入适合标记物的检测试剂进行显色或发光等，观察有无特异性蛋白条带的出现。 免疫印迹的实验包括五个步骤： ⑴ 固定：蛋白质进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）并从胶上转移到硝酸纤维素膜上。 ⑵ 封闭：保持膜上没有抗体的结合场所，使场所处于饱和状态，用以避免特殊性抗体单独结合到膜上。 ⑶一抗杂交：初级抗体（第一抗体）是特异性的。 ⑷二抗杂交：第二抗体或配体试剂对于初级抗体是特异性结合并作为指示物。 ⑸底物显色：被适当保温后的酶标记蛋白质区带，产生可见的、不溶解状态的颜色反应。 三、实验仪器 动物的常规免疫 Western－blotting 检测抗血清 动物的常规免疫 注射器 蜗旋混合器 四、操作步骤 动物的