基因工程5课件幻灯片.ppt

* 插入效应的筛选 　　插入效应筛选，可以根据靶基因与载体的特异性连接，所引发的重组子性状变化，来鉴定这个外源的靶基因究竟是否连接到了载体的指定位置。 　　插入效应，包括三种类型：插入失活，插入表达，以及噬菌斑形成筛选。 * 插入失活 　　插入失活，是由于核苷酸或一段外源性DNA插入到某个功能基因当中，从而引起了该基因的活性的丢失。 * 环丝氨酸筛选 * 插入表达筛选 　　　有的载体中，外源基因进入载体特定位置后，会激活一些抗性基因。这些抗性基因通常会产生相应的遗传性状。因此，通过转化子的检测这些遗传性状，就可以鉴定重组子。 * 蓝白显色筛选 * 　　在有些情况下，也可以通过插入载体的靶基因自身所携带的遗传表型，来对重组子进行鉴定。 利用插入序列提供的表型特征筛选重组子 * 载体提供选择植物或动物转化细胞常用的标记基因 　　　植物转基因经常用到的选择标记基因，包括：潮霉素磷酸转移酶基因，抗除草剂bar基因，荧光素酶基因等。 　　　动物的转基因，选用的标记基因更为复杂一些。 * 菌落的原位杂交筛选 　　　　菌落原位杂交是将细菌从培养平板转移到硝酸纤维素滤膜上，然后将滤膜上的菌落裂菌以释出DNA。将DNA烘干固定于膜上与32P标记的探针杂交，放射自显影检测菌落杂交信号，并与平板上的菌落对位。 * 　　　　人们发明了三种固相支持体，用于裂解细菌菌落并进行原位杂交。包括：硝酸纤维素滤膜、尼龙膜和Whatman滤纸等。 * 菌落原位杂交示意图 * 原位杂交的筛选过程 　　①待平板中的转化子菌落生长到人眼清晰可辨、大小稀疏适度时，将裁剪适宜的硝酸纤维素滤膜平铺到生长菌落的平板上； 　　②为确定滤膜与平板相对位置做好标记，将平板上的菌落原位附着转移到滤膜上一部分； 　　③小心取出滤膜，将附着菌体的一面朝上放置在预先被强碱溶液浸湿的普通滤纸上进行溶菌和碱变性处理，强碱可以裂解细菌、释放细胞内含物、降解RNA并使蛋白和DNA变性； 　　④溶菌变性约10分钟，将滤膜转移至预先用缓冲液浸湿的普通滤纸上中和强碱，可如此进行多次； 　　⑤将滤膜转移到清洗缓冲液中短暂浸泡约3分钟，漂洗菌体残片和部分蛋白质； 　　⑥取出滤膜，在普通滤纸上晾干，置80℃烘箱干燥1-2小时，使单链DNA牢固地结合在硝酸纤维素滤膜上； 　　⑦将硝酸纤维素滤膜放置在预杂交液(不合探针的杂交液)进行预杂交2－4小时，用以封闭滤膜减小对探针的吸附作用； 　　⑧将变性探针加到预杂交的滤膜中构成杂交液，在合适的温度和离子强度条件下进行杂交反应10－l6小时，离子强度和温度的选择取决于探针的长度以及与目的基因的同源程度，一般温度越高、离子强度越大，杂交反应越不易进行； 　　⑨杂交反应后需多次漂洗滤膜，直至除去未特异性杂交的探针，然后晾干； 　　⑩将滤膜与X线胶片压紧置于暗箱内曝光，依据胶片上感光斑点的位置，对应滤膜在原始平板上挑出相应的阳性重组子菌落。 * 核酸探针制备 　　核酸探针，指能与特定目标核酸序列发生杂交，并含示踪物的核酸片段(DNA或RNA)。 * 核酸探针获取思路 　　 1)现成可用的完整基因或基因的一部分，可以是DNA也可以是RNA，均可用于探针的制备。 　　2)通过文献或GeneBank查询所需基因的核苷酸序列，人工合成或PCR扩增获得探针用小片段。 　　3)根据目的蛋白的已知氨基酸序列推导合成一小段寡核苷酸序列，其长度一般为20～50bp。 　　4)利用蛋白质(酶)功能域保守性强的一小段氨基酸排列顺序，反推成两端的核苷酸序列作为引物，以PCR扩增获得编码蛋白基因的部分序列用于探针的制备。 　　5)cDNA是细胞基因表达逆转录的产物，可选择特定的组织细胞获取cDNA。标记后用于探针，对应高丰度mRNA的cDNA文库的筛选。 　　6)通过差示筛选法、减法杂交法或mRNA差别显示法等从目的细胞中筛选获得某些特异性的cDNA片段，将cDNA片段进行标记后成为探针。这类探针一般用于筛选cDNA文库中那些对应于低丰度mRNA的目的基因克隆。 * 核酸探针标记 ①标记物不会影响探针的主要功能； ②检测灵敏，特异性强，本底低，重复性好； ③操作简便，省时，经济实用； ④化学稳定性高，易于长期保存； ⑤安全无环境污染。 探针标记物条件 * 免疫学筛选 * 限制酶切分析筛选 * PCR扩增鉴定筛选 　　聚合酶链式反应(PCR)是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法,由高温变性、低温退火（复性）及适温延伸等几步反应组成一个周期,循环进行,使目的DNA得以迅速扩增,具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。 * 　　酶切重组ＤＮＡ分子鉴定，与ＰＣＲ鉴定，都要依赖于电泳对产物的检测。 凝胶电泳检测 * 第四章 DNA分子克隆 * *