原位杂交组织化学技术的基本方法核酸分子杂交技术-中国试剂网.PDFVIP

中国试剂网 3.18.6 原位杂交组织化学技术的基本方法 一、核酸分子杂交技术 1961 年 Hall 开拓了液相核酸杂交技术的研究，其基本原理是利用核酸分子单链 之间有互补的碱基顺序，通过碱基对之间非共价键的形成，出现稳定的双链区， 形成杂交的双链。自此以后，由于分子生物学技术的迅猛发展，特别是 70 年代 末到 80 年代初，分子克隆、质粒和噬菌体 DNA 的构建成功，核酸自动合成仪 的诞生，大大丰富了核酸探针的来源，新的核酸分子杂交类型和方法不断涌现。 按其作用方式可大致分为固相杂交和液相杂交两种：液相杂交是指参加反应的两 条核酸链都游离在溶液中，而固相杂交是将参加反应的一条核酸链固定在固体的 支持物上常用的有硝酸纤维素滤膜，其它如尼龙膜、乳胶颗粒和微孔板等），另 一条参加反应的核酸链游离在溶液中。固相杂交有菌落原位杂交（colony in situ hybridization ）、斑点杂交法（Dot blot ）、Southern 印迹杂交（Southern blot ）、Northern 印迹杂交（ Northern blot ）和组织原位杂交（Tissue in situ hybridization ），即原 位杂交组织化学技术和原位杂交免疫细胞化学技术。液相分子杂交技术包括吸附 杂交、发光液相杂交、液相夹心杂交和复性速率液相分子杂交等。 二、原位杂交组织化学技术的由来及发展 原位杂交组织（或细胞）化学技术简称原位杂交（In situ hybridization ），如上所 述，属于固相核酸分子杂交的范畴。但它区别于固相核酸分子杂交中的任何一种 核酸分子杂交技术。菌落杂交系细菌裂解释放出 DNA ，然后进行杂交。Southern 印迹杂交法是以鉴定DNA 中某一特定的基因片段，而Norhtern 印迹杂交法是用 以检测某一特定的RNA 片段的。它们都只能证明该病原体、细胞或组织中是否 存在待测的核酸而不能证明该核酸分子在细胞或组织中存在的部位。1969 年美 国耶鲁大学 Gall 和 Pardue 首先用爪蟾核糖体基因探针与其卵母细胞杂交，确定 该基因定位于卵母细胞的核仁中。与此同时，Buongiorno– Nardelli 和 Amaldi, John 及其同事等相继利用同位素标记核酸探针进行了细胞或组织的基因定位，从而创 造了原位杂交细胞或组织化学技术。Orth （1970）应用 3H 标记的兔乳头状瘤病 毒 cRNA 探针与兔乳头状瘤组织的冰冻切片进行杂交，首次用原位杂交检测了病 毒 DNA 在细胞中的定位，但当时的工作多采用冰冻组织切片或培养细胞，探针 均采用同位素标记。 中国试剂网 3.18.6 由于同位素标记探针具有放射性既污染环境，又对人体有害，且受半衰期限制等 缺点，科学工作者们开始探索用非放射性的标记物标记核酸探针进行原位杂交。 Bauman （1981）等首先应用荧光素标记 cRNA 探针做原位杂交，然后用荧光显 微镜观察获得成功。Shroyer （1982）报道用 2 ，4 二硝基苯甲醛（DNP ）标记 DNA 探针，使该 DNA 探针具有抗原性，然后用兔抗 DNP 的抗体来识别杂交后 的探针，最后经免疫过氧化物酶的方法来定位杂交探针。这两种方法至今仍有采 用，但因敏感度不够高，应用不够普遍。 Pezzella （1987）创建了用磺基化DNA 探针来做细胞或组织原位杂交的方法，其基本原理是使 DNA 探针的胞嘧啶碱基 磺基化，利用单克隆抗体识别磺基化探针，再通过免疫组化方法显示结合的单克 隆抗体，从而对杂交结合的探针进行定位。本法的优点是磺基化 DAN 探针标记 简便，不需作缺口平移标记，敏感度也较高。但自生物素和高辛标记探针技术建 立后，已有取而代之的趋势。生物素标记探针技术是 Brigat （1983）首先建立的， 它利用生物素标记的探针在组织切片上检测了病毒 DNA ，通过生物素与抗生物 素结合，过氧化物酶-抗过氧化物酶显示系统显示病毒 DNA 在细胞中的定位。生 物素标记探针技术目前已被广泛应用，特别是在病毒学和病理学的临床诊断中。 这种生物素标记技术又叫酶促生物素标记技术。另一种叫光促生物素标记核酸