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酶抑制法 残留农药的检测方法 -酶抑制法 生物制药2 三组 酶抑制法 . 有机磷、氨基甲酸酯类农药化学性质不稳定，在施用后，容 易受外界条件影响而分解。但有机磷和氨基甲酸酯类农药中存在着部分高毒和剧 毒品种，如甲胺磷、对硫磷 涕灭威、克百威、水胺硫磷等，如果被施用于生长期较短、连续采收的蔬菜，则很难避免因残留量超标而导致人畜中毒。 在一定条件下， 有机磷和氨基甲酸酯类药物对胆碱酯酶正常功能有抑制作用，其抑制率与药物的浓度相关，正常情况下 ，酶催化神经传导代谢产物（乙酰胆碱）水解，其水解产物与显色剂 反应，产生黄色物质，通过抑制率可以判断出样品中是否有高剂量有机磷或氨基甲酸酯类药物的存在。 酶抑制法 检测原理 利用有机磷和氨基甲酸酯类农药对动物体内乙酰胆碱酯酶（ AChE ）具有抑制作用的原理，在乙酰胆碱酯酶及其底物（乙酰胆碱）的共存体系中加入农产品样品提取液（样品中含有水），如果样品中不含有机磷或氨基甲酸酯类农药，酶的活性就不被抑制，乙酰胆碱就会被酶水解，水解产物与加入的显色剂反应就会产生颜色；反之，如果试样提取液中含有一定量的有机磷或氨基甲酸酯类农药，酶的活性就被抑制，试样中加入的底物就不能被酶水解，从而不显色。 水解 加酶 显色剂 未水解 显色剂 不显色 显色 无农药 有农药 酶抑制法 实验过程 酶抑制法 观察现象 用目测颜色的变化或分光光度计测定吸光度值，计算出抑制率，就可以判断出样品中农药残留的情况。 AChE 属于丝氨酸为中心的酶类，羧酸酯酶（非特异性酯酶的一种）与 AChE 类似，同样以丝氨酸残基作为活动中心。 酶抑制法 酶的基质和显色反应类型 1.酶的基质 酶抑制剂显色反应可使用的基质（底物）和显色剂很多。 各种乙酰胆碱（ ACh ）、乙酰萘酯以及其他羧酸酯、乙酸羟基吲哚及其衍生物 考虑：灵敏度，适用性，酶源、基质、显色剂获得难易 1. 肉眼观察法 酶片法、试纸法、速测卡法 基于反应体系反应前后明显的颜色变化来观察、判断农药 毒性高低的一种定性测量方法。 一般选用靛酚乙酸酯（红色）为底物。 检测方法 酶抑制法 酶抑制法 原理是： 胆碱酯酶可催化靛酚乙酸酯（红色）水解为乙酸与靛酚（蓝色），有机磷或氨基甲酸酯类农药对胆碱酯酶有抑制作用，使催化、水解、变色的过程发生改变，由此可判断出样品中是否含有有机磷或氨基甲酸酯类农药。 酶抑制法 速测卡以滤纸作载体，白纸片上载有乙酰胆碱酯酶和基质，红纸片载有显色剂。 当空白样品加于白纸片上，在酶作用下，乙酰胆碱与水发生水解，水解产物与显色剂反应产生颜色。当含有有机磷和氨基甲酸醋类农药的样品加于白纸片上时，抑制了乙酰胆碱酯酶的活性，使这种酶不能被水解，从而无显色反应。 酶抑制法 实验现象 白色药片变成蓝色，说明农药残留无或在检出限下； 白色药片不变蓝，说明含有超出检出限的农药。 酶抑制法 农药速测卡对几种常用农药的最低检测限（单位mg/kg）如下： 甲胺磷 1.7 马拉硫磷 2.0 水胺硫磷 3.1 对硫磷 1.7 久效磷 2.5 乙酰甲胺磷 3.5 敌敌畏 0.3 乐果 1.3 　 敌百虫　0.3 呋喃丹 0.5 西维因 2.5 好年冬 1.0 酶抑制法 （1）整体测定法 选取有代表性的蔬菜样品，擦去表面泥土，剪成 1cm 左右见方碎片，取 5g放入带盖瓶中，加入 10ml 纯净水或 0.1mol /L pH7.5 的磷酸缓冲液 〔 水与菜叶的比例以 ( 1 : l )~ ( l :2 ）为宜 〕 ，震摇 50 次，静置2min 以上。取一片速测卡，用白色药片蘸取提取液，放置 10min 以上进行预反应，有条件时在 37 ℃ 恒温装置中放置 10min 。预反应后的药片表面必须保持湿润。将速测卡对折，用手捏 3min 或用恒温装置恒温 3min ，使红色药片与白色药片叠合发生反应。每批测定应设一个纯净水或缓冲液的空白对照卡。 酶抑制法 （2）表面测定法 擦去蔬菜表面泥土，滴 2~ 3 滴洗脱液在蔬菜表面，用另一片蔬菜在滴液处轻轻摩擦。取一片速测卡，将蔬菜上的液滴滴在白色药片上．放置 10min 以上进行预反应，有条件时在 37 ℃ 恒温装置中放置 10min 。预反应后的药片表面必须保持湿润。将速测卡对折，用手捏 3min 或用恒温装置恒温 3min ，使红色药片与白色药片叠合发生反应。每批测定应设一个洗脱液的空白对照卡。 -酶抑制法 试纸法（速测卡法）操作简单、成本低，但对于深颜色样品的检测， 实验误差较大，而植物酶片用于植物样品检测时也存在基体干扰问题，操作者人为因素较大，灵敏度较低，只能勉强算是一种定性方法。 -酶抑制法