实验十四混合维生素E的正相HPLC分析条件的选择-化学实验教学示范.ppt

实验十四 混合维生素E的正相HPLC分析条件的选择 刘焕蓉 色谱法的起源 色谱法早在1903年由俄国植物学家茨维特分离植物色素时采用。 他在研究植物叶的色素成分时，将植物叶子的萃取物倒入填有碳酸钙的直立玻璃管内，然后加入石油醚使其自由流下，结果色素中各组分互相分离形成各种不同颜色的谱带。这种方法因此得名为色谱法。以后此法逐渐应用于无色物质的分离，“色谱”二字虽已失去原来的含义，但仍被人们沿用至今 在色谱法中，将填入玻璃管或不锈钢管内静止不动的一相称为固定相；自上而下运动的一相称为流动相；装有固定相的管子称为色谱柱。当流动相中样品混合物经过固定相时，就会与固定相发生作用，由于各组分在性质和结构上的差异，与固定相相互作用的类型、强弱也有差异，因此在同一推动力的作用下，不同组分在固定相滞留时间长短不同，从而按先后不同的次序从固定相中流出。 高效液相色谱法是一种以液体为流动相的现代柱色谱分离分析方法。流动相与组分之间有一定亲和力，分离过程的实现是组分、流动相和固定相三者间相互作用的结果，分离不但取决于组分和固定相的性质，还与流动相的性质密切相关。高效液相色谱一般可在室温下进行。由于采用颗粒极细的固定相，柱内压降很大，加上流动相粘度高，必须采用高入口压，以维持一定的流动相线速。高效液相色谱仪主要由贮液瓶、高压输液泵、进样系统、色谱柱、检测系统、数据处理系统组成。 液相色谱流程图 一、贮液瓶 用来保证色谱分离的重现性 高效液相色谱仪所用的洗脱液和注入系统的样品必须无固体微粒和纤维等，以免堵塞管道、色谱柱和影响泵单向阀的正常工作。因此，需选用不同材料的微孔滤膜过滤。 洗脱液进入高压泵前应脱气。因为如果流动相中所含有的空气不除，流动相通过柱子时其中的气泡受到压力而压缩，流出柱子后到检测器时因常压而将气泡释放出来，造成检测器噪声大，基线不稳，使仪器不能正常工作。这在梯度洗脱时尤其突出。 常用的脱气方法有： 加热法 减压法（抽真空） 惰性气体置换法（吹氦气等） 超声波法 在线脱气 1. 对泵的要求 a. 输出高压 b. 流量稳定（流量精度要高±％1） c. 流量调节范围大 d. 输出恒定、压力波动小，无脉冲 e. 耐腐蚀和耐磨损 f. 密封性能好 g. 室体积小，便于清洗 h. 适合于梯度洗脱 二、高压泵 附图1 三、进样系统 1、对进样系统装置的要求 2、进样系统 3、注射器进样装置 4、六通进样阀 5、自动进样器 1、对进样系统装置的要求 1. 密封性好 2. 死体积小 3. 重复性好 4. 保证中心进样 5. 进样时对色谱系统的压力、流量波动小 6. 便于实现自动化 2、进样方式 注射器进样装置 阀进样装置 六通进样阀 自动进样器 3、注射进样装置 优点 结构简单、造价低、操作方便、不以引起峰扩宽、柱效高 缺点 进样量小、操作压力不能超于100kg/cm2、重复性差、难于自动化 4、六通进样阀 六通进样阀是一种高压进样阀，也是现代色谱仪的一种优良的进样装置。 优点： a. 进样量可变范围大，进样量也较大，分析和制备通用，进样量由固定体积的定量管或者微量注射器控制 b. 重复性好　　一般可达0.5% c. 耐高压　可直接在高压下把样品 送入色谱柱，不需停留 d. 如果装上电动或者气动的驱动装置，可进行自动化进样 缺点： a. 阀的死体积大，容易引起色谱峰展宽 b. 柱效比注射器进样下降约10%，为使阀的高压密封性能好，因此制造工艺要求较高 四、色谱柱 色谱柱是高效液相色谱仪的核心部分，要求分离度高，柱容量大，分析速度快。高性能的色谱柱与固定相本身性能、柱结构、填装和使用技术等有关。 高效液相色谱柱大致分为三种类型：内径小于2mm称为细管径柱；内径在2～5mm范围的是常规高效液相色谱柱，作为一般分析用；内径大于5mm的一般称为半制备柱或制备柱。 1. 填料的特性决定色谱柱的性能 a. 填料的热力学特性影响色谱柱的选择性，决定色谱柱是否适合于所给定的分离。 b. 填料的动力学性质 影响色谱柱的效率 c. 现代色谱的发展主要是柱填料的发展 主要表现在填料动力学性质上的改进和提高装柱技术的革新，使柱效得到了新的突破，柱容量大为提高，从而提高了柱效 d. 从扩散和质量传递来考虑 填料粒度小，均有利于提高柱效高 粒度均匀、规则球形的颗粒易于填充均匀，也有利于柱效提高 2. 柱填料的类型 表面多孔型（薄壳）填料