真核基因表达系统复习课程.pptVIP

2）增强子 许多来源于病毒的增强子在不同种属细胞中都有极强的促进转录能力 SV40 enhancer RSV enhancer CMV enhancer LTR enhancer 3）筛选标记 胸苷激酶(tk)基因 Thymidine kinase gene 二氢叶酸还原酶(dhfr)基因 Dihydrofolate reductase ,dhfr 新霉素抗性基因 neomycin resistance gene 胸苷激酶(tk)基因 tk+细胞中：胸苷(T)→ 胸苷一磷酸 二氢叶酸 二氢叶酸还原酶 四氢叶酸 dCTP dATP dTTP 氨基喋呤(Aminopterin) tk 阻断 补加次黄嘌呤（Hypoxanthine） 死亡 存活 Dihydrofolate Thymidine （1） （2） （3） HAT 二氢叶酸还原酶基因筛选法原理 携带外源基因的载体连接有dhfr基因，可以表达二氢叶酸还原酶 以dhfr-细胞为受体 :CHO细胞 dhfr-细胞无法在普通培养基中存活，而转化入dhfr基因后可以存活，并表达外源基因。 若在培养基内加入甲氨蝶呤，进行加压筛选，可以提高外源基因表达量 新霉素的类似物G418对原核、真核均有毒 neo编码的酶可使G418灭活 此种筛选方法对受体细胞无要求，应用更简便 新霉素抗性基因(neo) 3、类型( types) 酵母克隆载体(yeast clone vector) ：不含酵母启动子，不能在酵母中表达外源基因，如YIP、YRP、YEP 酵母表达载体(yeast expression vector)：酵母克隆载体+酵母启动子,若引入信号肽序列，则成为分泌型载体 酵母人工染色体（yeast artificial chromosome, YAC) 克隆大片段DNA， 2μM质粒：酵母核质中的小的环状DNA，可以独立复制并转录。 （1）酵母克隆载体的构建 酵母整合型质粒( yeast integrated plasmid. Yip) 细菌质粒DNA+酵母遗传标记，通过同源重组整合入酵母染色体，转化子稳定，但转化率极低。 酵母复制型质粒(Yeast replicable plasmid, YRp) 细菌质粒DNA+酵母遗传标记(YIp)+酵母复制序列(ARS),可自主复制，但稳定性差 酵母附加子型质粒, YEp ：细菌质粒DNA+酵母标记基因(YIp)+酵母2μM质粒，游离于核外存在并自主复制 酵母复制序列 酵母2μM质粒 （2）酵母表达载体 特点：含酵母启动子 穿梭载体(shuttle vector)： 既可以携带外源基因在原核细胞中复制，又可以使其在真核细胞中表达的载体。 种类：啤酒酵母表达载体 毕赤酵母表达载体： 分泌型表达载体 非分泌型表达 啤酒酵母表达载体 毕赤酵母表达载体------整合型 (3) 酵母人工染色体（yeast artificial  chromosome,YAC)----克隆大片段DNA 由下列元件组成 酵母染色体 2umDNA的复制起始区 着丝粒序列（CEN) 四膜虫端粒DNA(TEL) YAC: 利用酵母的着丝粒区段（CEN ）、自动复制序列（ARS）及四膜虫端粒DNA(TEL)构建的人工染色体 结构： 左臂：TEL、选择标记、ARS 、CEN 右臂：TEL、选择标记 特点：容量大（50-1000kb），稳定性差 作用：构建基因组文库 二）受体细胞 1.啤酒酵母： 较早使用，了解清楚 安全性高，被FDA确认为安全生物 表达量较低 过量糖基化 转化子不稳定，易发生质粒丢失 2. 毕赤酵母：新发展的酵母受体细胞 高表达（12g/L） 高稳定-----载体为整合型 高分泌（10g/L） 三）转化 1. 原生质体法：去除厚壁 2.电穿孔法：效率较高，整合型载体转化前要酶切线性化 3. LiCl法：做成感受态细胞 四）外源基因在酵母菌中的表达 1、胞内表达：直接表达外源基因， 如：HBsAg的酵母重组疫苗 2、分泌表达：在MCS前加入信