双功能葡激酶突变体（RGDSak，DGR）的中试研究及其PLGA缓释微球的研制.pdfVIP

英文缩写 博士论文 双功能葡激酶突变体(RGD—Sak，DGR)的中试研究 及其PLGA缓释微球的研制 摘要 本实验室在基因工程葡激酶(Sak)研究的基础上，构建了新型葡激酶突变 体(RGD一$ak，DGR)，它不但保持了野生型葡激酶的溶栓活性，而且具有明显的 抗血小板聚集的功能，动物实验证实了DGR具有溶栓和抗栓等药理学效用。此外， 与野生型Sak相比，DGR在豚鼠体内的免疫原性明显下降。在此基础上，我们进 行了DGR中试规模的表达与纯化工艺研究。DGR免疫原性低，有望成为预防血栓 性疾病的药物。但是，DGR与Sak一样，分子量小，体内半衰期短，静脉用药不 宜于作为预防性药物。缓释微球载药系统可克服这一缺点。因此，研究具有缓释 功能的DGR微球制剂具有重要应用价值，我们首次研制了葡激酶突变体缓释微球 制剂。 利用DGR工程菌在30L发酵罐中，高效表达DGR，表达产物约占菌体总蛋白 的50％0。离心收集菌体，用高压匀浆法破碎菌体，离心后上清用硫酸铵分级沉 淀，沉淀的蛋白溶解后经凝胶过滤和阴离子交换纯化，得到高纯度、高活性的 DGR半成品。加入辅剂、无菌过滤、分装和冷冻干燥后得成品。纯化后的产品纯 AU／mg，每升发酵液可获得DGR220mg，纯化活性收率在45％以上。中试工艺具 有操作简便、稳定、回收率高的优点，易于放大至生产规模。我们初步建立了中 试产品的制造和检定规程。 使用复乳溶剂挥发法制备了含DGR的PLGA微球，研究了搅拌速度、PLGA浓 度、内水相和外水相中的添加剂对蛋白包封率以及微球性质的影响。并进行了 DGR微球的体外和体内释放试验。为了提高DGR在包封过程中的稳定性，研究了 DGR水溶液与二氯甲烷形成乳液时，吐温--80、聚乙二醇、甘露醇、蔗糖和聚乙 烯醇(PVA)对DGR稳定性的影响，发现吐温--80、聚乙二醇、甘露醇、蔗糖均 不能提高DGR的回收率；只有PVA有效抑制超声乳化时DGR在水／二氯甲烷界面 上的变性，使DGR的活性回收率从16％提高到几乎90％以上，并且PVA对DGR 的保护作用呈现量效关系。在外水相中加入NaCl可以显著提高蛋白包封率，同 时使微球表面的孔洞变小，微球内DGR的分布更加均匀。DGR微球的体内、外释 放呈现两个时相，即突释期和随后的缓释期，DGR体外以活性形式释放可达到15 博士论文 摘要 天以上；肌肉注射微球后，DGR在兔体内缓释释放达到5天以上。我们的试验结 果表明，PLGA微球是DGR的良好载药系统。 DGR从微球中的释放不完全，我们对PLGA微球释放过程中造成DGR变性聚 集的因素进行了分析发现，PLGA降解产物产生的微球内酸性微环境会导致DGR 的变性聚集。内水相中加入Mg(0H)。可减少DGR变性，提高DGR稳定性。此外PLGA 的表面吸附也是DGR释放不完全的重要原因。 用傅里叶变换红外光谱法(FT—IR)定量研究了PLGA微球内DGR的二级结构。 将可增强分辨率的傅里叶去卷积技术与高斯曲线拟合技术共同用于微球内DGR 酰胺I带的定量分析，发现DGR酰胺I带共包含九个红外吸收峰，并对各组份进 行了归属，还对微球内DGR结构稳定性相关的1623和1650eml吸收峰进行了讨 论。 关键词：葡激酶突变体纤溶和抗血小板聚集双重功能中试研究微球制剂研究 中图分类号：0816； R945 2 DOCTORALDISSERTATION ABSTRACT Pi ofastaphaIokinase 101：production and i onofi tssustained—reIeasei11i Preparat crosphere ABSTRACT The variant and