圆弧青霉碱性脂肪酶基因的克隆、定点突变及其表达的研究.pdfVIP

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2018-03-31 发布于福建
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圆弧青霉碱性脂肪酶基因的克隆、定点突变及其表达的研究.pdf

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摘要摘要本论文以圆弧青霉BD26(PeniciHiumcyclopium 增出编码脂肪酶的774bp成熟肽基因片段。序列测定结果表明，该序列与圆弧青霉基因 AAG22769)同源性高达99％。脂肪酶基因Lip PD。三种重组菌工程菌BL21／pET-28a．LipPD、BL21／pTrc99a．LipPD和BL21／pET-25b．Lip 体在固体琼脂显色平板上都形成了明显透明圈。SDS．PAGE电泳显示，在三种宿主菌中都含有分子量约为27kDa的活性脂肪酶蛋白。对工程菌BL2 PD表达条件优 1／pTrc99a．Lip BL21／pET-25b．LipPD周质溶液经NaOH滴定法测定，比酶活为24．19U／mg。经定点突变证明，S132、D1 PD的三联体催化活性中心。LipG24C 88和H241的确为Lip 反应温度为30。C，与原酶相比提高了5C，比酶活为34．59U／mg，是野生型的1．43倍。经过抗性和表型筛选，从抗性为3．OOmg／mLG418的平板上挑选15株重组工程菌 GSl 15中表达量不高。酶活，仅为10．53U／mg。SDS．PAGE电泳显示，重组蛋白在宿主菌GSI 关键词：圆弧青霉，碱性脂肪酶，克隆，表达，定点突变，大肠杆菌，毕赤酵母 Abstract Abstlact TotalRNAwasisolatedfromPenicillium BD26withTRIzol one Cyclopium reagentby method．A774 PD was ofnucleotide step bpLip gene amplifiedbyRT-PCR．Analysis ofthe that PD shared withthe sequencefragmentsuggestedLip gene hi【ghsimilarity gene ofPenicillium Penicillium sequences Cyclopium(GenBank：AF274320)andExpansum to (GenBank：AAG22769)up99％identity． ThecDNA themature Wasclonedinto encoding peptide expressionplasmid coli and inEscherichia pET-28a(+)、pTrc-99apET-25brespectively,andexpressed BL2 band27kDa detected IPTGinduction of Was 1(DE3)by respec