蛋白质复性ProteinRefolding.PDFVIP

第十章蛋白质复性 Protein Refolding 本章内容 • 10.1 包含体的形成和性质 • 10.2 包含体的纯化和溶解 • 10.3 蛋白质复性 10.1 包含体的形成和性质 一、包含体 重组蛋白质的高表达导致其在胞内发生错误折 叠和聚集，形成的蛋白质聚集体称为包含体 (inclusion body) 。 蛋白质，大部分为基因表达产物 一级结构正确，立体结构错误，没有生物活性 蛋白质的体外再折叠或复性 回收，溶解，恢复天然构型 二、包含体的形成 • 一般认为包含体的形成是部分折叠的中间态之间 疏水性相互作用的结果，主要原因是蛋白质本身 具有易于聚集沉淀的性质，或表达产物周围的物 理环境（如温度、离子组成）不适或缺少某些折 叠辅助因子（如分子伴侣）的作用。 包含体的形成是蛋白质过量表达的结果，而与蛋 白质的种类和表达系统无关。即包含体的形成与 其相对分子质量、疏水性以及折叠途径等内在性 质没有必然的联系。 二、包含体的性质 • 高密度蛋白质聚集体，通常位于细胞质中，主 要成分为基因表达产物。 以包含体形式表达重组蛋白具有如下优势： （1）包含体蛋白质主要在以大肠杆菌为宿主细胞的原核 细胞表达系统中形成，而大肠杆菌生长速度快，易于高 密度培养，有利于大规模生产目标蛋白质； （2 ）包含体蛋白质的表达量都很高； （3 ）利于后续分离纯化； （4 ）包含体内的目标蛋白不易被蛋白酶水解； （5 ）解除目标蛋白对宿主细胞的毒害或杀伤作用。 三、包含体的体内抑制 • 有些蛋白质很难进行体外复性，特别是相对分 子质量较大、结构复杂和含有较多二硫键的蛋 白质。 抑制包含体的形 成： 降低细胞培养温度；将目标蛋白质与分子伴侣 蛋白、折叠酶和二硫键异构酶共表达；使用非 代谢性碳源降低代谢速度和蛋白质表达量；将 目标蛋白质与亲水性蛋白质融合表达。 10.2 包含体的纯化和溶解 • 蛋白质复性包括：包含体的分离纯化、包含体 的溶解和复性等步骤。 一、包含体的分离纯化 • 回收和纯化（一般方法）： • （1）细胞破碎 • （2 ）离心沉降回收包含体 • （3 ）粗包含体的洗涤（螯合剂、低浓度变性 剂、表面活性剂） • （4 ）离心沉降回收包含体 • （5 ）根据需要，重复上述步骤（3 ）和（4 ） ，直至达到满意的包含体纯度。 二、包含体的溶解 • 溶解 变性剂： 5～8mol/L盐酸胍、8mol/L尿素 硫氰酸盐、表面活性剂（十二烷基磺酸钠，十 六烷基三甲基氯化胺等） 还原剂： 1～100 mmol/L的二硫苏糖醇； 1～200 mmol/L的β-巯基乙醇或半胱氨酸 10.3 蛋白质复性 l分子内折叠和分子间聚集的动力学竞争过程。 k On-pathway k k I N UUU III NNN k A Off-pathway AAA 蛋白质体外复性的主要挑战： 创造适宜的复性操作条件，促进正确折叠、 抑制聚集体生成，提高复性收率。 主要影响因素 l变性剂浓度（脲、盐酸胍） l氧化还原剂浓度、比例 lpH l蛋白质稳定剂（甘油、海藻糖…） l蛋白质浓度