角蛋白结构功能与角蛋白遗传病技术 培训.ppt

角蛋白结构功能与角蛋白遗传病 ; 角蛋白结构与功能 角蛋白遗传病基因突变和临床系列研究 ;角蛋白简介;角蛋白 目前已知49种,34种细胞角蛋白,15种毛 发角蛋白;角蛋白基因结构;;;11;角蛋白不同结构区氨基酸数统计;角蛋白序列的保守性 1. 不同个体之间的保守性:1A起始部和2B末端 15-20aa 2. 不同角蛋白之间的保守性 螺旋起始区: I型 1A区第7个aa始 LNDRLASY II型 LNNKFASY 螺旋终止区: EIATYRKLLEGE(如K1 2B末端倒数第5个氨基酸) ;角蛋白功能;角蛋白基因敲除小鼠的表型;角蛋白与疾病;;角蛋白中间丝的装配; 角蛋白遗传病基因突变 和临床系列研究 ;技术路线和实验方案;先天性厚甲症(Pachyonychia congenita,PC)是一组常染色体显性遗传病,特点是甲营养不良和不同程度的外胚叶发育不良。 ;根据临床表现主要分为两型;PC患者的厚甲通常是在出生后头几个月出现 。一些PC患者甲改变发生较晚,称为迟发性先天性厚甲。 多发性脂囊瘤通常在青春期发生。 研究发现,PC-1由于角蛋白K16、K6a基因突变所致,PC-2由于角蛋白K17、K6b基因突变所致。;先证者及其子的厚甲;先证者头部多发性脂囊瘤 ;先证者及其子的多发性脂囊瘤;先证者及其子的局灶性掌跖角化 ;28;29;研 究 方 法; 1. 血样采集 采集家系成员(包括9例患者、1例正常人)外周血3～5ml,2％EDTA抗凝,-70℃冷冻保存。另外抽取正常对照50人份外周血做同样处理。; 2. 外周血基因组DNA提取 用全血基因组DNA纯化试剂盒提取基因组DNA。 ;3. 聚合酶链反应(PCR) ; K17P8和K17P10扩增的DNA片段稀释1:10000倍作为巢式PCR模板。 巢式PCR的上游引物序列为: 5′-GCTGCTACAGCTTTGGCTCT- 3′;下游引物序列为5′-CACGACGTTGTAAA ACGACCAGTCACGGATCTTCACC- 3′。 ;PCR反应:总体积为50μl,反应液成分包括5μl缓冲液,10mmol/L dNTP 1μl,25μmol/L上、下游引物各1μl, Taq酶0.5μl(2.5U),25 mmol/L MgCl2 5μl,模板10μl。 反应条件:;4.基因测序 PCR产物采用全自动DNA测序仪进行序列测定,测序结果进行同源性分析。 ;结 果; ;2. PCR反应结果 PCR反应产物电泳,扩增出大小为978 bp的DNA片段(Marker 为DGL2000) 。;patient;3 DNA测序结果;讨 论; 体外实验表明,1A区起始部的突变对角蛋白装配影响较大,而1A区后半部的突变对角蛋白装配影响较小。临床上发现的角蛋白突变位于1A区后半部的较少。;角蛋白17模式图及我们发现的突变位置;我们发现的突变为角蛋白K17的N109D突变, 为一新的错义突变。因此,在进行中国人PC- Ⅱ型基因诊断或产前诊断时,除了参考国际上已报道的突变位点外,应注意这一新的突变位点的可能性。; 我们报道的这一PC- Ⅱ家系,厚甲均为迟发(10至20岁发生),基因突变位于K17 1A区的后半部,为一新的突变N109D。;结合Connors等和我们的研究结果,K16 2B区中间部和K17 1A 区后半部的基因突变可以呈现为迟发型厚甲。 我们的研究结果表明角蛋白的突变位置与疾病的发生年龄有关。发生在角蛋白非关键部位的突变引起疾病迟发。 ;通过2个家系初步的研究表明,中国PC-2型患者基因突变与其他种族相比,有相同之处,又有不同之处。本研究为进行中国人PC-2型基因诊断及产前诊断奠定了基础。;单纯型大疱性表皮松解症的基因突变及临床研究 Investigation on Gene Mutations and Clinical Phenotypes of Epidermolysis Bullosa Simplex ;1. 临床资料;;双足跖可见大疱及灶状角化过度;家系谱图;散发病例一 ;双手掌、腕部可见水疱、大疱;2. HE染色结果 ;3. PAS染色观察 ;皮损附近基底层细胞可见有空泡,提示水疱裂隙位于表皮内。;4. 透射电镜观察 ;;散发病例二 ;;;散发病例一和散发病例二系谱关系见下图 ;K5基因外显子4-5直接测序