多肽：N乙酰氨基半乳糖转移酶2的克隆、分布和酶家族基因芯片的研究.pdfVIP

多肽：N．乙酰氨基半乳糖转移酶．2的克隆、分布和酶家族 基因芯片的研究 摘要 多肽： 肽链上特定序列中的苏氨酸或丝氨酸残基形成Ⅱ糖苷键。 此酶参与O．聚糖合成 的第一步，是一个大家族，已发现由14种亚型，分别称为ppGalNAcTl一T14。 广泛分布于各组织，不同亚型的ppGalNAc．T有不同的组织分布，对多肽底物有 不同的专一性。本文选择人类中发现最早的ppGalNAc．T2为代表，从人脑基因 库中将其克隆和鉴定，并用RT-PCR和原位PCR研究它在六种细胞株和六种正 常人体组织中的分布和定位，最后制备了以上14种ppGalNAc-T的基因片段， 制成基因芯片，比较胃癌细胞和神经胶质瘤细胞中14种ppGalNAc．T的表达谱。 本文共分三个部分。 第一部分 多肽：N-乙酰氨基半乳糖转移酶-2的基因克隆， 序列鉴定及其在大肠杆菌的初步表达 从人脑基因文库中克隆出ppGalNAc．T2的可溶性部分(高尔基体腔内的茎部 5’端第154—1716位核苷酸)，经 和催化结构域)，其eDNA片段长度为1563bp(焚3 pDONRTM201质粒转入原核表达质粒pFASTBAC中，两个重组质粒均经线性化 长度鉴定，加以克隆PCR或酶切鉴定，测得插入ppGalNAc．T2片段的长度也约 杆菌中表达出59．2kDa的蛋白质产物，其分子量与520个氨基酸序列计算的结 果相同。 第二部分多肽：N-乙酰氨基半乳糖转移酶一2在不同细胞 和组织中的表达 用RT-PCR两步及一步法分别测定了六个细胞株和六种正常人体组织中 mRNA的表达。一般说来，凡分泌粘液粘蛋白较多的组织或其恶 DpGalNAc—T2 性细胞株均有ppGalNAe．T2较高的表达，如人大肠和胃组织、胃癌和卵巢癌细 胞株；而不分泌粘蛋白的组织或细胞株则表达ppGalNAc-T2很少或较少，如肾 脏和肝脏，NIH3T3成纤维细胞，神经胶质瘤和多发性骨髓瘤细胞株。但有例外， 如K562白血病细胞株也有ppGalNAc．T2的很高表达。人脑和心肌表达中等程度 ppGalNAc．T2的阳性表达颗粒主要存在于粘膜层的细胞核旁高尔基体所在处，癌 旁平滑肌为阴性。胃癌组织中ppGalNAe．12表达并非很高，反而低于正常冒粘膜。 第三部分 多肽：N．乙酰氨基半乳糖转移酶家族 表达谱的基因芯片研究 用合成的14对正、反向引物，以人结肠、脑等组织eDNA库为模板，采用 Yl～T14基因序列中编码区或3’．端非编码区(UTR)近 PCR法制各了ppOalNAe 1000个核苷酸序列的产物。再用TOPO．TA克隆法克隆至DH5Ⅱ工程菌，经筛 选扩增细菌、质粒抽提、鉴定等步骤制碍了14种ppGalNAc．T的eDNA片段库， 用于基因芯片的点阵。PCR产物均经两次限制性内切酶单一性位点切割证明具 有不同的序列，TOPO．TA克隆产物均经克隆PCR作长度鉴定及测序鉴定。将细 eDNA 胞样品提取的mRNA，经逆转录及生物素标记与基因芯片上的T1～T14 进行分子杂交，采用化学发光法检测信号。结果发现：胃癌细胞株中 1，T13，T14)。脑胶质瘤细胞株中以 则表达很少(T3、T7、T12)或不表达(T6，T8．T1 表达也很少或不表达。 关键词：多肽：N．乙酰氨基半乳糖转移酶，0一糖链，基因克隆，RT--PCR，原 位PCR，基因芯片，胃癌，细胞株。 Studiesou and of the cloning，distributionenzymefamily-genechip Abstract