第七章 色谱分离技术.pptVIP

（3）基本操作 装柱 上样 洗脱 吸附剂 干法装柱 湿法装柱 被分离物质 干法上样 湿法上样 梯度洗脱，各组分先后被洗出 （二）亲和吸附剂的制备 载体的选择 配基的选择 载体的活化与偶联 1.载体的选择 ① 具有较好的理化稳定性和生物惰性 ② 具有大量可供活化和配基结合的化学基团 ③ 高度的水不溶性和亲水性 ④ 有稀松的网状结构使大分子能自由进入 ⑤ 有良好的机械性能，颗粒均匀 2.配基的选择 ① 特殊配基 抗原的抗体，酶的专一抑制剂，激素的受体 ② 通用配基 可适于一类物质的分离提纯 3.载体的活化与偶联 载体具有惰性 先活化再与配基偶联 活化的作用： 载体表面活化后产生的活性基团可在简单的化学条件下与配基上的氨基、羧基、羟基或醛基等发生共价结合 （三）影响吸附亲和力的因素 配基浓度：高 空间障碍：在载体与配基之间插入多烃链“手臂” 配基与载体的结合位点 载体孔径 （四）操作方法 具有亲和力的一对分子中的一个作为配基，与不溶性载体结合，使之固化，装入色谱柱 含目的物的混合液作为流动相进入色谱柱，配基选择性吸附目的物质，杂质不能被吸附而直接流出。 改变条件使配基与其亲和物解离 亲和层析的基本过程： 具体操作： ① 样品制备 含杂质，需预处理： ② 配体与配基结合条件的选择 pH、缓冲液浓度、离子强度 ③ 柱操作 ④ 流速的控制 ⑤ 清洗 ⑥ 洗脱 ⑦ 柱的再生 蛋白沉淀、离子交换柱层析 柱的大小、长短 高速度、高效率 除去不结合的所有物质 特异性洗脱（竞争性置换目的物） 非特异性洗脱（调节pH、离子强度和种类、温度） （五）亲和色谱法的应用 1.亲和色谱法的特点： 专一、高效、简便、快速 2.应用 ① 分离和纯化各种生物分子 纯化生物大分子，适于从组织或发酵液中分离以下物质：杂质与目的物间的溶解度、分子大小、电荷分布等性质差异小，相对含量低，其他经典手段分离有困难的高分子物质；尤其是对分离某些不稳定的高分子物质更具有优越性。 如：酶、rRNA、抗原和抗体的分离，激素的提纯 ② 分离纯化各种功能细胞、细胞器、膜片段和病毒颗粒 ③ 用于各种生化成分的分析检测 ④ 与亲和色谱有关的特殊技术应用 二、吸附色谱法 依靠溶质与吸附剂之间的分子吸附力的差异而分离的方法。 吸附剂是一些多孔性物质，表面布满许多吸附位点，即活性中心。吸附色谱过程就是样品中各组分的分子与流动相分子不断争夺吸附剂活性中心并不断达到平衡的过程。 被吸附的物质称为吸附物。 吸附力主要是范德华力，有时也可能形成氢键或化学键。 （一）基本原理 溶液中某组分的分子在运动中碰到一个固体表面时，分子会贴在固体表面上，发生吸附作用。 1.发生吸附作用的原理： 固体表面分子（或原子）与固体内部分子（或原子）所处的状态不同： 固体内部分子（或原子）受临近四周分子的作用力是对称的，作用力总和为零，即彼此互相抵消，故分子处于平衡状态。 界面上的分子所受的力不对称，作用力总和不等于零，合力指向固体内部。 2.吸附的类型： 物理吸附 化学吸附 交换吸附 物理吸附 化学吸附 产生方式 分子力（范德华力） 库仑力(电子转移，生成化学键) 活化能 低 高 进行温度 低温 高温 释放热量 小 很大 速度 较快，容易达到平衡 慢，平衡慢 选择性 不严格 强 交换吸附： 吸附剂表面如果由极性分子或离子组成，则会吸引溶液中带相反电荷的离子形成双电层，同时放出等物质的量的离子，发生离子交换。 离子的电荷是决定因素，离子所带电荷越多，在吸附剂表面的相反电荷点上的吸附力越强。 电荷相同的离子，水化半径越小，越容易被吸附。 3.常用的吸附剂： 有机吸附剂： 无机吸附剂： 活性炭、纤维素、大孔吸附树脂、 聚酰胺 氧化铝、硅胶、人造沸石、磷酸钙、 氢氧化铝 按化学结构分 4.吸附色谱的基本过程和分类 固定相对各组分吸附力的大小次序： （1）过程 （2）分类 吸附薄层色谱法 柱色谱法 操作方法的不同 5.吸附薄层色谱法 （thin layer chromatography, TLC） 薄层色谱法：将吸附剂或支持剂均匀的铺在玻璃板上，铺成一薄层，然后把要分离的样品点到薄层的起始线上，用合适的溶剂展开，最后使样品中各组分得到分离。 （1）原理： 利用混合物中各组分的物理化学性质的差异，在层析过程中，在不相溶的两相中分布不同，从而达到分离的目的。 吸附剂：涂布在薄层板上 （固定相） 展开剂：在展开过程中流过固定相的溶剂 （流动相） 两相 将待分离的样品溶