海洋蜡样芽孢杆菌Y2 Quorum Quenching N乙酰高丝氨酸内酯酶克隆及其蛋白结构与功能研究.pdfVIP

海洋蜡样芽孢杆菌Y2 Quorum Quenching酶基因 克隆及其蛋白结构与功能研究 摘要 本研究旨在细菌通过监控某些信号分子的浓度可感知其群体大小，进而调节 整个群体的行为，使其能与多细胞生物一样，行使单个细胞无法完成的功能，这种 依赖细胞密度的细胞信息交流现象被称为细菌群体感知系统(quorumsensing，简 称QS)。而抗细菌群体感知系统被称为细菌群感淬灭(quorumquenching)。细菌 的多种重要的生理生化功能及其表型特征都与QS系统介导的信号转导有关。由 于QS系统参与了多种病原细菌致病性的产生，因此在发展抗细菌感染新疗法的 研究中，该系统被认为是一个重要的作用靶点。Ⅳ-乙酰高丝氨酸内酯 (N-acyl—homoserine 一类调控大多数革兰氏阴性菌QS系统的信号分子。目前已在多种细菌和真核生 物中发现了可降解AHLs信号分子的酶，如Ⅳ-乙酰高丝氨酸内酯酶 inactivation，AiiAs)，这 (AHL．1actonases)，又称自诱导物失活剂(autoinducer 类酶极具医疗应用潜力，分离和发现新的QS系统抑制生物和酶十分有利于新型 抗生素和生物防控制剂的开发。 本研究建立了一种OS系统抑制活性菌的平板筛选模型，该模型以根癌农杆 物)共培养物的颜色反应判断待测菌有无AHLs降解活性，具有简便、经济、直 观的特点。 目前已有报道的QS系统抑制生物都分离自土壤、植物等陆地生长环境，而 群体感应现象最初是在海洋发光细菌Hbriofischeri中首次发现的，但至今鲜见海 洋细菌QS抑制现象的报道。本研究分别从海南陵水县海域和深圳大亚湾海域的 不同采样点采集海水样品，有限稀释法涂布平板分离细菌，通过三次划线纯化分 离到的菌株，并应用已建立的Os抑制生物检测模型筛选其中具有AiiA活性的海 洋细菌。其中，菌株Y2具有明显和稳定的AHLs降解活性。对Y2进行形态学、生 理生化鉴定及16s rDNA序列分析，鉴定该海洋细菌应归类于真细菌目、芽孢杆 BacilluscereusY2。 cereus 本研究用限制性内切酶Sau3Al消化BacillusY2菌株的基因组DNA，并 cereus Y2的基因组文库。 与经BamHI酶切的pBACe3．6质粒连接，构建了Bacfflus cereusY2的基因组 根据已女laiiA基因的保守区域序列设计一对探针，对Bacillus 文库进行southern blotting分析，结果显示该海洋细菌的基因组文库中存在aim基 7,Fn3 因的同源保守片段。进一步利用与aiiA基因57术端互补的简并引物进行PCR 扩增，扩增出海洋细菌Y2内编码Ⅳ_乙酰高丝氨酸内酯酶的基因Y2．alia的全长序 发现Y2．aim为一新基因，但与GenBank数据库中其它同类基因有高度的同源性： Y2．AiiA的重组表达，并利用镍离子螯合层析技术对带有N。端6×His标签的 Y2．AiiA蛋白进行了纯化，得到一分子量约为28kDa并具有AiiA活性的蛋白表达 产物。 为深入了解该来源于海洋的Ⅳ-乙酰高丝氨酸内酯酶的结构和功能特点，利用 同源建模的方法建立了Y2一AiiA蛋白的3D结构，发现该蛋白由5个a．螺旋和12个 0一折叠构成，属a0／Bo型蛋白超家族；B一折叠形成该蛋白内部排列紧密的核 心，a．螺旋包围着由B一折叠形成的蛋白核心，构成蛋白外部可溶性的片层结构。 在此三维结构的基础上，进行Y2一AiiA酶蛋白与AHL底物的Docking分子对接模拟 这三个保守的氨基酸残基在Y2．Ai认蛋白的三维结构中占据了催化部位，Tyrl94