一氧化碳中毒实验和形态学综合实验技术一重点培训.pptVIP

一氧化碳中毒实验和形态学综合实验技术; 目的和要求; 实验技术路线; 实验内容; 操作步骤;2．实验组动物: 给予一氧化碳吸入,待小鼠出现明显呼吸困难、烦躁、晕厥时开瓶塞,使小鼠苏醒; 对照组动物: 不吸入一氧化碳; ; 3．第二天重复上述操作, 连续四天, 致小鼠急性中毒死亡。 ; 4．切开小鼠皮肤, 用咬骨钳打开颅骨,  暴露脑组织; ; 5．分离脑膜后,进行大体观察: ﹡ 脑体积变化, ﹡ 脑沟变化, ﹡ 脑回变化, ﹡ 有无出血、坏死灶;; 6．取出脑组织, 置于固定液 ; 7. 石蜡包埋技术: 8. 分别染色: HE染色技术 免疫组化染色技术;石 蜡 包 埋 技 术; 在显微镜下要观察人体组织,必须将组织切成以微米为单位的薄片,使其透光并易于观察,但直接切取柔软组织是难以办到的。;石蜡包埋法是将“支持物质”----石蜡渗入组织 内部,为此,必须先将组织中水分除净,用 酒精进行脱水(70％→80％→90﹪→95﹪→l00％)。 再用二甲苯或冬青油置换出组织中的酒精, 使其透明,然后放入融化的石蜡中。将浸蜡的 组织块置于包埋框中,冷却后组织块便具有石蜡 的硬度,切片机便能将组织切成薄片。; 三 操作步骤 ; 4. 脱水 通常多用酒精脱水,为减少组织收缩,脱水酒精的浓度必须由低浓度开始,逐级升高浓度。 60﹪ (1h)→70﹪ (1h)→80﹪酒精(1h)→90﹪ (1h)→95﹪I(1h)→95﹪II(1h)→100﹪I (1h)→100﹪ II (30min)。注意: 脱水的具体时间视组织块大小体积与厚度而定。 ;自动脱水机; 5.透明 透明剂常有二甲苯、冬青油等等。常用方法:1/2冬青油→冬青油→二甲苯洗涤。 6.浸蜡 将透明组织移入已熔化的石蜡中,使熔化的石蜡能浸透到组织中,然后包埋成组织蜡块。浸蜡过程在温箱中进行,温度不能超过60oC,温度过高或时间过长,组织容易收缩和脆变。方法:1/2石蜡→石蜡I→石蜡II→石蜡III。 ; 7.包埋 将组织块和石蜡置于包埋框内,冷却即成蜡块,组织获得了一定硬度和韧度,就可以切成微薄的切片。 ; 8.切片 载玻片先用蛋白甘油处理; Leica切片机进行切片,厚5μm; 45oC漂烘仪内进行展片。 9.裱片 10.烤片; HE 染色实验技术 ;   苏木精(hematoxylin) : 碱性染料  伊红(eosin):酸性染料 ; 操作步骤 ; 2、苏木精染色:5~ 10 min,核染成蓝色。 3、分色:0.5﹪盐酸酒精分色,镜下控制。 4、蓝化:自来水冲洗1~ 2h。; 5、伊红染色:1--2 min,将胞质染成红色。 6、分色:90﹪酒精分色,镜下控制。 ; 7、脱水:95﹪酒精 → 100﹪酒精 X 2 8、透明:二甲苯 X 2 9、封片:用中性树胶进行封片 。 ;  免疫组织化学技术; ﹡免疫组织化学技术是根据抗原与抗体特异性结合的原理,检测组织中的肽和蛋白质的一种技术。 ﹡把人和动物的某种肽和蛋白质作为抗原注入另一种动物体内,该动物便会产生针对抗原的特异性抗体。将抗体提取与标记物结合,即成为标记抗体。; ﹡ 将标记抗体与组织切片孵育,抗体则与组织中相应抗原特异性结合,在显微镜下通过观察标记物而获知该肽或蛋白质的分布部位。 ﹡ 常用标记物有荧光素、辣根过氧化物酶、胶体金等。 ﹡ 酶标抗体的染色分直接法和间接法。; 直接法 将酶直接标记在抗体上,再用标记抗体与样品中的抗原直接结合 。 该方法操作简便,但敏感性不及间接法。;直接法(A); 间接法 将分离的抗体(第一抗体简称一抗)作为抗原免疫另一只动物,制备该抗体的抗体(第二抗体简称二抗),将酶标记在第二抗体上。先后以一抗和二抗处理样本,最后形成抗原----一抗----标记二抗复合物。间接法中的一个抗原分子通过一抗和多个标记二抗相结合,因此它的敏感性较高。;间接法(B); 抗生物素(avidin)又称卵白素或亲和素,是从卵白中提取出的一种糖蛋白,1个抗生物素分子与生物素( biotin )有4个结合位点,两者有很强亲和力,相互结合后形成不可逆的复合物。;在ABC反应中,用生物