龙葵蛋白酶抑制剂的分离纯化、原核表达及其生化特性.pdfVIP

巾文摘要 龙葵蛋白酶抑制剂的分离纯化、原核表达 及其生化特性 专业： 生物化学与分子生物学 博士生：王震字 导师： 徐增富教授 摘 要 americonuminhibitor 龙葵蛋白酶抑制剂lla(30lonumproteinasella,SaPIN2a) 基因是第一个被发现在植物韧皮部中特异表达的蛋白酶抑制剂II(PIN2)基因．已 报导的研究结果表明，SaPIN2a可能参与龙葵韧皮部的分化发育，在植物生长发 育方面具有重要的生理功能。但是至今未能从龙葵中分离纯化到天然的SaPIN2a 蛋白，也没有在原核生物中成功获得有抑制活性的重组SaPIN2a的报导，因而对 其各种理化特性的研究都是根据其cDNA序列推导出的氨基酸序列进行预测的． 为了深入探讨SaPIN2a结构与功能及其与其它蛋白之闯的相互关系，有必要从龙 对其生化特性进行分析。一方面可进一步研究SaPIN2a在植物体内的生理功能， 为植物韧皮部的分化发育研究提供线索；另一方面也可为在医药和农业方面开发 应用SaPlN2a莫定基础． 本研究以野生型龙葵的茎为材料，经过一系列的分离纯化操作，最终纯化得 kDa．对 到一个丝氨酸蛋白酶抑制剂，SDS结果显示其表观分子量约为20 该纯化的丝氨酸蛋白酶抑制剂进行了蛋白质测序工作，结果得到该蛋白N端23 序列． Ⅲ 手键’j， 尼接蛋白牌抑制剂的分离纯化、原核表达与生化特竹= 本研究确定天然SaPIN2a是以二聚体形式存在，其二聚体『自J的相互作用力 kDa。 由疏水作用力提供，经MALDI-TOFMS测得其单体分子量为13．73 可能是糖基化和磷酸化。天然SaPIN2a具有较高的热稳定性，其紫外特征吸收 峰为269nm。天然SaPIN2a能抑制胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶， 但对于木瓜蛋白酶和组织蛋白酶D没有抑制效果。天然SaPlN2a是胰蛋白酶的 竞争型抑制剂，酶浓度为7．5nmol，L时，其l(i=6．4±0．47nmoFL，IC50=137．1 ±8．8nmoFL；它还是胰凝乳蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶的非竞争型抑锘4剂，当胰 凝乳蛋白酶浓度为25nmoFL时，其磁=22．8±4．3nmoFL。ICso；33。4±4．6 nmol／L，ICso= nmoFL；当枯草杆菌蛋白酶浓度为167nmol／L时，l(i=80．3±2．1 74．4±1．6脚扎。天然SaPIN2a能抑制斜纹夜蛾和粉纹夜蛾5龄幼虫的中肠类 胰蛋白酶活性，且对斜纹夜蛾的类胰蛋白酶抑制效果更明显，但对两种害虫的 类胰凝乳蛋白酶活性均没有抑制效果。 SaPIN2a的兔抗。成功表达并纯化得到了具有胰蛋白酶抑制活性的重组蛋白 MS测定得 rSaPIN2a(M)的分子量为13．44kDa。测定了重组蛋白rSaPlN2a(M)对不同蛋白 nr∞FL，该 酶的抑制效果，当胰蛋白酶浓度为7．5nmoFL时，IC50=398．6±8．1 值比天然SaPIN2a大了近3倍；当胰凝乳蛋白酶浓度为25rmloVL)时，IC50=36．1 ±1．7nmoFL，与天然SaPIN2a相比相差不大；而对于枯草杆菌蛋白酶的抑制作 用非常小，无法计算其Ic∞值。相比于天然SaPIN2a与枯草杆菌蛋白酶的摩尔 比为l时就可抑制95％的酶活性，rSaPIN2a(M)在与枯草杆菌蛋白酶的摩尔比 达到近60；l，才仅仅抑制了30％左右的酶活性。