基因转殖斑马鱼卵母细胞于产制新型抗高血压胜肽之应用-大叶大学.pdf

基因轉殖斑馬魚卵母細胞於產製新型抗高血壓胜肽之應用 The Application of Transgenic Zebrafish (Danio rerio) Oocytes in Production of the Novel Anti-hypertensive Peptide 1∗ 1 1 1 1 1 2 1# 李建旻 謝婉玲 邱洪磬 周承翰 林巧淳 朱書宏 陳小玲 黃尉東 1大葉大學 分子生物科技學系 (彰化縣大村鄉學府路 168 號) 2大葉大學 生物資源學系 1# kater@mail.dyu.edu.tw 摘要 高血壓（hypertension ）疾病至今為國人十大死因之一，同時亦是罹患心血管疾病之風險因子。然隨 消費者預防保健意識之提升，控制血壓相關機能性食品與類藥物營養劑之需求已日益增加，其中預防高 血壓之血管緊縮素轉化酶抑制胜肽（angiotensin converting enzyme inhibiting peptide ，ACEIP ）更受矚目。 目前國立中興大學生命科學系陳全木教授與大葉大學分子生物科技學系陳小玲教授已自kefir grain 發酵 乳原料中分離出一新穎之抗高血壓胜肽（anti-hypertensive peptide No. 1 ，AP1 ），經定序解析後發現此關 鍵胜肽為β-酪蛋白（β-casein ）中一特定片段之胜肽，其活性表現亦優於現有市售之調節血壓健康食品產 品之關鍵主成分 VPP 與 IPP 。本研究以先前斑馬魚（zebrafish ，Danio rerio ）為模式動物產生抗菌蛋白 （anti-microbial peptide ）平台技術之經驗，針對上述之功能性蛋白生產進行試驗。本試驗將抗高血壓胜 肽AP1 基因構築於斑馬VTG 之啟動子下游，續將之選殖入pAAV-IRES-hrGFP 及pEGFP-N1 之表現載體， 並以吳郭魚卵巢細胞株（tilapia ovary ，TO-2 cells ）分析其表現，並以顯微注射導入斑馬魚受精卵內，觀 察並分析其表現位置。結果顯示於細胞轉染第48 小時後可觀察到其綠螢光之信號，續以RT-PCR 與西方 墨點反應分析，進一步證實具綠螢光蛋白之表現。SDS PAGE 分析亦顯示AP1 蛋白之可能表現。另將上 述之載體以顯微注射之方式轉置至斑馬魚胚胎中之結果顯示，於注射後24 、72 、120 及 168 小時以螢光 顯微觀察於卵黃囊或肝臟皆具綠螢光之表現，此親代斑馬魚並可產製具螢光表現之第二子代斑馬魚。因 此，本試驗已將AP1 基因成功轉置於斑馬魚基因組中，後續將可藉斑馬魚為生物反應器產製抗高血壓胜 肽（AP1 ）並進行功能性分析。 關鍵字：斑馬魚、基因轉殖、抗高血壓胜肽、卵母細胞 前言 據行政院衛生署報告高血壓（hypertension ）疾病歷年至今均為國人十大死因之前十位（七至十名）， 平均每天約有5 人因高血壓疾病而死亡，且十大死因中與高血壓相關之慢性病即佔了一半（包括腦血管 疾病、心臟疾病、糖尿病、腎炎腎症候群及腎性病變及高血壓性疾病），並占總死亡人數的三分之一，其 亦為多數已開發國家主要慢性病及死亡原因之一 。高血壓意指血壓超過正常範圍，亦即收縮壓（systolic 1 blood pressure; SBP ）超過 140 毫米水銀柱（mmHg ），或舒張壓（diastolic blood pressure; DBP ）超過90 mmHg ，除家族性遺傳外，並與高血壓與吸菸、飲酒、體重控制及運動習慣極具相關性。依據行政院衛 生署國民健康局94 年「國民健康訪問調查」訪查2 萬7 千多名民眾之結果發現，12 歲以上民眾自述罹 患高血壓者佔 11.8％，且隨著年齡增加而遞增，40 歲以上佔23.1％，即約每4 人就有 1 人患有高血壓， 而65 歲以上更高達每2.5 人即有 1 人，且此些罹患高血壓之民眾約有2