cdna的第一链合成反转录.ppt

第四节 用克隆cDNA作为反应物 一、RNA印迹 二、RNase 保护实验 三、核连缀转录分析 二、RNase 保护实验 RNA酶保护试验(RPA) 是一种利用反义RNA探针与基因表达产物进行液液杂交，对RNA进行定性定量分析的有效方法． 向待测RNA溶液中加入过量的反义RNA探针，互补的部分形成RNA—RNA杂交分子．经RNase选择性水解去除未形成杂交双链的单链．测定未被RNase水解的RNA’探针的长度及含量，即可对待测RNA进行定量和定性析． RPA灵敏度极高，由于用RNase水解RNA—RNA杂交反应中，由单链RNA产生的假带少。 反义RNA探针的制备 反义RNA:与mRNA互补的RNA分子, 也包括与其它RNA互补的RNA分子。 将外源DNA片段插入载体，载体在MCS两侧带有启动子，在RNA聚合酶作用下可以进行RNA转录，添加α-32P-CTP，则DNA两条链中的一条为模板转录生成RNA。所合成mRNA均掺入同位素而得到标记。 通过改变外源基因的插入方向可以控制RNA的转录方向，即以哪条DNA链以模板转录RNA。这种可以得到同义RNA探针（与mRNA同序列）和反义RNA探针（与mRNA互补）。 反转录酶 双链cDNA 优点： 检测灵敏度比Northern杂交高 ； 没有扩增过程，分析的数据真实性较高； 由于与反义RNA探针杂交的样品RNA仅为该RNA分子的部分片段，部分降解的RNA样品仍可进行分析； 步骤较少，耗时短； RNA-RNA杂交体稳定性高，无探针自身复性问题。 一个杂交体系中可同时进行多个探针杂交，无竞争性问题。 检测分子长度可以任意设置，灵活性大。 缺点：需要同位素标记探针 * 1—5% mRNA，80—85% rRNA，10—15% tRNA。 * 4 这与基因组文库中的单拷贝基因均具有相同的克隆数相较，这是两种文库的另一差别。5（一般选用的载体都是表达型的） * 所使用的杂交探针是mRNA反转录成的cDNA群体，在这些同位素标记的探针中，真正能与目的基因核苷酸序列完全互补的仅占很低的比例，以至于那些低丰度的mRNA之cDNA克隆，是很难用此法检测出来 * 也不会直接发生相互作用 * 还有两种可以在大肠杆菌和酵母中自主复制的穿梭载体，是按正确的取向和读码结构被克隆在载体的多克隆位点区内，于是靶蛋白和GAL4-BD之间产生融合作用，形成杂种蛋白质? * 1、作用信号是在融合基因表达后,在细胞内重建转录因子的作用而给出的,省去了纯化蛋白质的繁琐步骤。(1) 检测在真核活细胞内进行,在一定程度上代表细胞内的真实情况。 4检测的结果可以是基因表达产物的积累效应,因而可检测存在于蛋白质之间的微弱的或暂时的相互作用， (5) 通过mRNA 产生多种稳定的酶使信号放大。同时,酵母表型,X—Gal 及HIS3 蛋白表达等检测方法均很敏感。 * （这是大多数假阳性的诱因）。 * 所得的噬菌体制剂可用来做进一步富集有期望结合特性的目标噬菌体。 * 用s1水解RNA：DNA反应中单链核酸产生的假带少 * 与Northern杂交相比，省去了转膜和洗膜的过程。 操作过程 简并探针的假阳性 由于探针库中只有一种是与目的基因完全互补的，其它的探针有可能与不相关的片断杂交，产生假阳性信号。 方法： 1、制备“猜测体探针” 2、PCR猜测体技术 解决方法： 1）制备“猜测体探针” 一种人工合成的用于分离克隆基因的低简并性的寡核苷酸探针，其核苷酸序列是根据特定物种当中某种已知蛋白质的密码子使用频率，同时又采纳了根据猜测最可能在目的基因中出现的密码子资料，选择含有密码子简并程度最低的蛋白质区段进行合成。 较长的唯一的寡核苷酸序列，它能够大范围的却不能够完全的同靶序列互补。 2）PCR猜测体技术 步骤： 1、根据末端32个氨基酸序列，设计PCR简并引物； 2、以cDNA为模板；对目的基因特异性扩增； 3、产物连接到载体上克隆，用唯一猜测体探针杂交 ，选择阳性克隆； 4、分离的克隆中部为32氨基酸序列，两侧为引物序列； 5、用这段插入序列为探针，筛选噬菌体cDNA文库。 根据末端32个氨基酸序列，设计PCR简并引物，以cDNA为模板，进行扩增 用猜测探针杂交筛选阳性克隆 PCR-猜测体探针 二、抗体探针 利用免疫学的原理，检测克隆基因的表达产物。 抗体鉴别阳性克隆 用专门设计的表达载体，将真核基因编码的蛋白质在大肠杆菌中实现表达，通过免疫化学法进行检测。 三、差示杂交 需要两种不同的细胞群体（目的基因正常表达、目的基因不表达），分别制备两种不同mRNA提取物，以两种总mRNA探针（或以相应的cDNA作探针)平行杂交，对有表达目的基因的细胞总mRNA构建的克隆文库进行筛选。 差别杂交的局限性： 1.杂