基因转移技术讲解和基因打靶技术讲解 2.ppt

第十章 基因转移技术和基因打靶技术 第一节 概 述 转基因动物(transgenic animal)是指用重组DNA技术将外源基因导入基因组内，使之能在动物体内表达并稳定传代的一类动物。 整合到动物染色体基因组上的外源基因称转基因。 只有部分组织细胞整合有外源基因的动物称嵌合体动物。 基因剔除动物是指运用基因剔除技术将特定 的内源基因剔除后的动物。 基因剔除是指外源DNA与受体细胞基因组中序列相同或相近的基因发生同源重组而整合到受体细胞的基因组中，是特定的内源基因被踢除。 基因替换动物是指运用基因锲入技术，使外源基因编码区取代与某种生理现象相关的基因编码区后获得的动物。 基因锲入技术（基因置换技术）是指使双链DNA的断裂点发生在同源序列的边缘或者同源序列之外，是外源DNA取代内源靶序列的新技术。 1982年美国华盛顿大学Palmiter等将大鼠生长激素基因导入小白鼠的受精卵里，再将这一受精卵植入借腹怀孕的母鼠体内，生下一个比正常体格大一倍的“超级小鼠”。 按照转基因小鼠的思路，人们已经成功的获得了转基因大鼠、鸡、山羊、绵羊、猪、兔、牛、蛙、鱼等。 转基因动物制作的关键技术包括： 1.外源目的基因的分离 2.转基因与包含启动子、增强子、报告基因等元件的载体拼接重组 3.重组的转基因导入生殖细胞或胚胎干细胞 4.转基因胚胎的培养和移植 5.转基因胚胎发育生长的鉴定及转基因动物品系的筛选 6.外源目的基因整合率及表达效率的检测 第二节 动物转基因技术的基本原理与方法 基本原理： 制备目的基因，构建重组转基因载体，导入 生殖细胞或着床前胚胎细胞 ，将转基因受精卵或着床前胚胎细胞植入子宫或输卵管 ，发育成转基因动物。 一、目的基因的制备和转基因载体的构建 （一）目的基因的制备 1、cDNA法扩增目的基因 2、双链DNA与载体连接构建重组体 3、将重组体转入受体菌 4、筛选和鉴定重组体 5、扩增获得大量重组体 （二）转基因载体的构建 载体通常由结构基因及其调控序列组成。常常在载体中附加半乳糖苷酶或绿色荧光蛋白等报告基因。 根据不同目的选择相应调控序列：如观察外源基因表达的生物学效应，即选择表达效率高而无组织特异性的强启动子如CMV、pGK等。如观察外源基因再特定靶器官的功能，即选择组织特异的启动子。 线性DNA分子比环形DNA分子更容易整合到染色体上。 （一）显微注射法 1.目的基因的制备 2.小鼠的准备和要求 3.受精卵的分离 4.显微注射 5.受精卵的移植 6.转基因小鼠的鉴定 二、转基因方法 （二）反转录病毒法 原理： 反转录病毒的核酸为一条单链RNA分子，其基因由两部分组成，一是顺式作用序列，为病毒复制和整合所必需；二是反式作用序列，编码病毒的包装蛋白。将外源基因取代反式作用序列构建成重组载DNA。 另外将包装蛋白基因导入专门的细胞并使之整合到染色体上，形成包装细胞。 如果重组病毒DNA导入这种包装细胞中，病毒包装蛋白能将DNA包装成具有感染力的重组蛋白颗粒，能浸染动物细胞而将重组DNA引入宿主细胞。 （三）精子载体法 精子载体法是精子和外源DNA混合培养时，外源DNA可直接进入精子的头部，通过受精将外源基因引入动物细胞中。 外源DNA导入精细胞的方法有DNA与精子共育法、电穿孔导入法、脂质体转染法。 （四）电穿孔法 利用高压电脉冲击穿细胞膜，使外源基因通过膜孔进入细胞。 原理是将受体细胞置于高压电脉电场中，加入外源基因，通过电压使细胞产生可逆性的穿孔。外源基因通过膜孔进入细胞，从而改变受体细胞的遗传物质组成。 瞬间 细胞 细胞膜核膜通透性增加 高压脉冲 DNA渗入细胞 （五）体细胞核移植法 1997年，英国科学家Schnieke和Wilmut等通过体细胞核移植技术成功克隆了“多莉”。 原理： 将外源目的基因导入能传代培养的动物体细胞，从阳性转基因细胞中分离细胞核，通过显微注射或电穿孔将这种导入细胞核去核的成熟卵母细胞中。将重组胚移植到代孕受体，进而获得带有外源目的基因的转基因动物。 （六）受体介导法 是将外源DNA与受体分子连接后与胚胎细胞共培养，受体可以介导外源DNA进入受体细胞，从而实现基因转移。 1999年，Ivanava用受体介导法制作了转基因鼠。 （七）磷酸钙沉淀法： 目的基因与磷酸钙等物质混合，形成沉淀的DNA微细颗粒，易通过细胞膜进入细胞内，并整