第六章节,大肠杆菌表达体系.ppt

第六章 大肠杆菌中表达系统; 基因工程的重要目标之一,是制备大量的纯化蛋白质产物。为此就需要有一种能够高水平表达异源真核蛋白质或重组蛋白质的表达系统 良好的表达系统应包括多方面的因素，如寄主细胞的生长特性、蛋白质产物转移后的修饰与生物活性，以及异源蛋白质的表达水平及分泌方式等 目前这种表达系统有细菌、酵母、昆虫、植物和哺乳动物细胞等 大肠杆菌表达系统具有明显的优越性;;;;大肠杆菌高效表达真核基因,涉及到三方面 强化蛋白质的生物合成 主要为外源基因剂量（拷贝数）、基因转录水平、mRNA翻译速率的时序性控制，这种控制是在重组分子构建过程中通过相应表达调控元件的精确组装来实现 抑制蛋白产物降解 维持或恢复蛋白质特异空间构象 ;6 外源基因在大肠杆菌中的表达;;启动子;;采用galK为报告基因的pKO1载体系统优点 1、可以根据转化子细胞中半乳糖激酶的产量的多少，鉴定启动子的强弱 2、根据在麦氏培养基中的菌落颜色特征，分离功能启动子 ;(2)滤膜结合法分离 双链DNA不能与硝酸纤维素薄膜有效结合，而DNA-蛋白质复合物却能在一定条件下结合在膜上 将待检测DNA片段与RNA聚合酶保温，并转移至膜上，温和漂洗薄膜，除去末结合RNA聚合酶的双链DNA片段，再用高盐溶液将结合在薄膜上的DNA片段洗下 DNA片段在膜上的滞留程度与其同RNA聚合酶的亲和性(即启动子的强弱)成比例 这种强弱难以量化，需要将之克隆在探针质粒上进行检测 ;;;;lacUV5启动子，是由lac启动子衍生而来，部分序列有些改变。野生型的lac启动子要启动转录必须具备两个条件：活化蛋白和cAMP等正调控因子，和乳糖或IPTG等解除负调控的物质同时存在。而lacUV5比野生型lac启动子更强，且对分解产物抑制不敏感，不需要活化蛋白和cAMP。在仅有乳糖或IPTG存在时就能启动转录;;;双质粒表达系统;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;包涵体蛋白的变性与复性操作 1、收获与洗涤：包括细菌的收获、洗涤、破碎和离心收集适当的组分。一般在5000-10000g离心分离包涵体 洗涤液可用1%以下的中性去垢剂如Tween、Triton、NP40等，并在其中加入EDTA和二硫???糖醇（DTT）、巯基乙醇等还原剂，盐浓度保持在50mmol/L水平。也可以用低浓度盐酸胍或尿素与中性去垢剂、EDTA等还原剂共同组成洗涤剂。其目的是去除吸附在包含体表面的不溶性杂蛋白，加入的洗涤液可通过柱层析等方法去除;;;;;;;;;;;;;; 融合蛋白中的大肠杆菌蛋白或多肽部分除了具备高效表达的基本条件外，还同时具会下列特性中的一种或多种 维持整个融合蛋白分子的理想空间构象，以增加其水溶性 促进融合蛋白定位于细胞周质或外膜，以实现其可分泌性 提供融合蛋白一个用于亲和层析分离的靶多肽序列以简化异源蛋白的纯化程序 有时为了使融合蛋白分子同时具备上述多重特性，也可选用两种受体菌功能多肽编码序列;将目的基因与绿色荧光蛋白基因（GFP）融合，通过绿色荧光蛋白的荧光效应以对目的蛋白进行细胞或亚细胞定位;Actin;;目的蛋白的回收;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;胰岛素的结构及其生物合成;;;;;;;;;;;;;;;