常用液相色谱柱原理使用与维护保养_精品.ppt

②冲洗与饱和：清堵紧固后，先反向连接色谱柱，不接检测器，用纯水或水-有机相（多用甲醇、乙腈）（95:5）以0.3ml/min流速冲洗约4h→再换成甲醇以0.5ml/min流速冲洗约2h→再正向连接色谱柱，接或不接检测器，用纯水或水-有机相（多用甲醇、乙腈）（95:5）以0.3ml/min流速冲洗约2h→再换成甲醇以0.5ml/min流速冲洗约1h→然后用甲醇或乙腈以1ml/min流速冲洗约1h以上，再根据测试用流动相比例调整水-甲醇（或乙腈）比例，以1ml/min流速冲洗约1h，最后用测试用流动相平衡2h，进样测试即可。 ③特别说明：如不是特殊情况，按其他办法可行，则最好不要反冲色谱柱和拆卸筛板。 （2）柱效降低：主要特征性现象有柱压基本正常，但出现拖尾峰、秃峰、分叉峰、前延峰、峰变宽、基线漂移、理论板数降低、分离度降低等。需要进行再生处理，具体方法如下： * ①一般情况下，顺接色谱柱，按如下溶剂顺序及条件冲洗：95%水-5%甲醇（或乙腈）（1.0ml/min，1h以上）→100％甲醇（1.0ml/min，1h以上）→100％乙晴（1.0ml/min，1h以上）→75％乙晴-25％异丙醇（0.5ml/min，10倍柱体积以上）→100％异丙醇（0.5ml/min，10倍柱体积以上）→100％二氯甲烷（0.5ml/min，10倍柱体积以上）→100％正己烷（0.5ml/min，10倍柱体积以上，根据实际情况可忽略）→100%异丙醇（0.5ml/min，20倍柱体积以上）→95%水-5%甲醇（或乙腈）（0.5ml/min，30min；再升至1.0ml/min，10倍柱体积以上）→检测用流动相平衡2h或至基线平稳，进样测试。在冲洗过程中，随时关注柱压变化，确保不超过4000psi；若超出，可通过降低流速，升高柱温来调整，具体操作可咨询具备相关专业知识背景和实践经验的人士。 * ②若上述方法效果不理想，可按如上溶剂顺序和条件，先反接色谱柱冲洗→再顺接色谱柱，用100%乙腈以1ml/min流速冲洗约2h→再用与流动相同比例的水-有机相以1ml/min流速冲洗约30min→最后用流动相平衡2h或至基线平稳，进样测试即可。 ③特别说明：再生过程必须随时关注柱压变化，柱压过高易导致硅胶变形与开裂及键合相极性端连接顺序紊乱，同时要保证再生时间足够。 （3）当分析复杂样品时间过长，尤其是中药分析，若出现柱压正常而色谱峰形变差，分离度降低时可尝试如下方法再生：先用5%甲醇（或乙腈）-95%水，将色谱柱反向连接，以1ml/min冲洗60分钟以上→再用四氢呋喃（或丙酮）以0.5ml/min冲洗60分钟以上（去除脂类）→再用65%甲醇（或乙腈）-35%水，以流速1ml/min冲洗60分钟→然后用纯甲醇或乙腈冲洗30分钟→接着用与流动相同比例的水-有机相以1ml/min流速冲洗约30min→最后用流动相平衡2h，进样测试即可。 * （4）特别提醒：再生时最好选择不具备在线脱气的独立泵送系统 色谱仪器进行，以防正相溶剂损坏脱气机密封膜或分子筛及比例阀等仪 器精密部件。 3.2正相色谱柱（Normal –Phase Chromatography column） 3.2.1氨基柱（-NH2） ①在正相条件下使用时，故障率较低。但要注意不可进样含有醛基、羰基的化合物，不可用于还原糖的分析；流动相要彻底脱气，并不得含有羰基化合物和过氧化物（质量较差的乙醚、四氢呋喃等溶剂中含有少量）。任何时候更换流动相时都要确保新流动相与柱子原保存液可互溶，若不互溶，必需用异丙醇过渡。 * 当使用氨基柱进行酸性物质分析时，酸性物质溶液有质子存在，会使略带负电荷的氨基官能团质子化，导致使用一段时间后被测成分保留性质有所改变或柱效下降。这时，建议按如下方法处理： 首先用异丙醇，以0.5ml/min流速，冲洗约50倍柱体积→然后用甲醇，以0.5ml/min流速，冲洗约50倍柱体积→再用异丙醇，以0.5ml/min流速，冲洗约10倍柱体积过渡，回到平常使用的正相流动相平衡2h，进样检测即可。若上述方法不凑效，可尝试按以下程序冲洗与再生： 首先用含0.5%～1.0％NH3的50%乙腈-50%水溶液，以1.0ml/min流速冲洗该柱约5～10倍柱体积→然后用不含NH3的50%乙腈-50%水溶液，以1.0ml/min流速冲洗该柱约5～10倍柱体积以洗去多余NH3→再用添加少许NH3（如0.1％）的酸性分析物的流动相平衡2h左右，进样检测即可。 * ②在反相条件下使用时，-NH2键会水解，尤其是在该柱子pH范围以外，在极端酸性和碱性条件下柱效会下降很快，所以故障率较高。若出现柱压增高柱效降低