蛋白质与蛋白质、DNA相互作用研究方法介绍加实例.ppt

将荧光蛋白分割成两个不具有荧光活性的分子片段 分别与目标蛋白连接. 如果两个目标蛋白因为有相互作用而靠近，就使得荧光蛋白的两个分子片段在空间上相互靠近，重新形成活性的荧光基团而发出荧光 Identification of the SIRTUIN1 (SIRT1)-binding domain of BMAL1.? Binding of SIRT1 to BMAL1 deletion mutants was analyzed by bimolecular fluorescence complementation (BiFC). COS7 cells were transfected with plasmids encoding SIRT1-N-terminal of Venus (VN) and BMAL1-C-terminal of Venus (VC) wildtype (WT) or its various mutants (Δnuclear localization sequence [NLS], BMAL1 without a functional nuclear localization signal; Δbasic-helix-loop-helix [bHLH], encoding BMAL1 Δ71 to 140; ΔPer-Arnt-Sim [PAS]-A, BMAL1 Δ210 to 320; ΔPAS-B, BMAL1 Δ350 to 480; Δtranscriptional activation domain [TAD], BMAL1 Δ553 to 625). The images were captured by fluorescence imaging microscopy using specific filter sets for yellow fluorescent protein and red fluorescent protein. * * 蛋白质与蛋白质的相互作用研究方法 蛋白质与DNA相互作用研究方法 蛋白质与蛋白质的相互作用的研究方法 酵母双杂交系统Yeast Two-Hybrid Systerm 免疫共沉淀Co-immunoprecipitation (Co-IP) GST pull-down 技术 荧光共振能量转移Fluorescent Resonant Energy Transfer （FRET） 双分子荧光互补（Bimolecular Fluorescent Complement）BIFC 蛋白质芯片技术 其它方法 酵母双杂交系统 1.1 酵母双杂交技术的原理 酵母双杂交系统由Fields和Song等首先在研究真核基因转录调控中建立。他的产生是基于对酵母转录因子GAL4性质的研究. 基因转录不仅需要有特定的DNA顺式序列结构，而且也需要有反式转录激活因子的参与。 转录激活因子往往由两个或两个以上相互独立的结构域构成,其中有DNA结合结构域(DNA binding domain, DB)和转录激活结构域(activation domain, AD), 它们都是转录激活因子发挥功能所必需的。 单独的BD或AD都不能激活基因转录，但不同转录激活因子的DB和AD形成的杂合蛋白仍然具有正常的激活转录的功能。 如果要研究两个蛋白之间有无相互作用，可以把这两 个蛋白分别与DB和AD形成的融合蛋白。 与DB 融合的蛋白称为“诱饵”(bait)， 与AD融合的蛋白称为“猎物”(prey)。 如果这两个蛋白能发生相互作用, 这两个融合蛋白上的 DB和AD就能重新形成有活性的转录激活因子, 从而激活 报告基因(reporter gene)的转录与表达。 通过检测报告基因的表达产物, 可判别“诱饵”和“猎物” 这两个蛋白质之间是否存在相互作用。 1.1 酵母双杂交技术的原理 同时将上述两种载体转化改造后的酵母，这种改造后的酵母细胞的基因组中既不能产生GAL4，又不能合成LEU、TRP、HIS、ADE，因此，酵母在缺乏这些营养的培养基上无法正常生长。当上述两种载体所表达的融合蛋白能够相互作用时，功能重建的反式作用因子能够激活酵母基因组中的报告基因HIS、ADE、LACZ、MEL1，从而通过功能互补和显色反应筛选到阳性菌落。 Yeast two hybrid assay. Direct yeast two hybrid experiment with the constructs FAM124B-1,3-pGA