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痰及呼吸道标本检验程序1.检验目的：检出痰及支气管灌洗液中的病原微生物，进行体外抗生素敏感试验，为临床诊断与抗生素选择提供依据。2.范围: 适用于呼吸道标本。3.程序原理：根据涂片、培养基上菌落形态特点、优势菌群分布选择可能的病原菌进行生化反应鉴定和药敏试验，通过微生物分析手段，为临床提供诊断依据和抗生素选择。4.所用设备：VITEK2全自动细菌鉴定/药敏分析系统、 CO2 培养箱、II级生物安全柜、厌氧箱、恒温培养箱、显微镜、酒精灯、接种环、移液器、吸头。5．试剂：血液培养基、巧克力培养基、麦康凯平板培养基、沙保弱培养基及根据临床需求增加特殊的培养基、革兰染色液、抗酸染液、VITEK2鉴定卡、手工生化鉴定试剂、K-B药敏纸片、MIC药敏板、无菌盐水、反应板、各种培养基、触酶试剂、氧化酶试剂、凝固酶试剂等 。6.标本采集：见临床微生物标本采集和送检程序（YLJY-WSW-PF-6-8）。7.检验程序：7.1直接涂片检查 呼吸道标本必须做涂片检查，可确定标本是否来自下呼吸道，初步判定是否有病原菌存在、细胞增生情况以及病原菌与细胞的关系。7.1.1痰涂片及标本来源判断 （1）挑取脓性或血部分制备2张涂片，一张做革兰染色，另一张根据需要做其它染色。（2）革兰染色低倍镜观察白细胞和上皮细胞数量：白细胞＜10，上皮细胞＞25，确定为上呼吸道标本，不宜做培养，电话通知主管医生要求重留标本。如果临床坚持继续，在申请单和结果报告单注明；若白细胞＞10，上皮细胞＜25时，要参照高倍镜下的情况进行区分：①有少量扁平上皮细胞、少量白细胞、3种以上细菌，说明为唾液，不宜培养。②见数量不等的白细胞或纤毛柱状上皮细胞或二者同在，有一种细菌或两种，记录结果，同时进行培养。（3）标本证实来自下呼吸道后，油镜观察细菌着色、形态及排列，有经验技师可通过镜检做出初步病原学诊断，如葡萄球菌、肺炎链球菌、真菌。如果临床医生坚持对不适宜标本进行培养，要特别注明。判断是否适宜培养的痰显微镜检查结果见下表分类白细胞上皮细胞判断A2510合格B2525合格C1025不合格7.1.2一般细菌涂片检查：革兰染色镜检，跟据着色、形态及排列大致可以初步推断菌属或种，如见到革兰阳性球菌、呈堆或葡萄状排列，疑似葡萄球菌；如见到瓜子形态、矛头状、尖端相背的成双排列并有荚膜的革兰阳性球菌疑似肺炎链球菌等。7.1.3 抗酸染色涂片检查： 结核分枝杆菌抗酸阳性（樱红色）、细长略弯、有时呈分枝状、多成堆排列。抗酸杆菌报告方式－: 全视野或（100个视野）未找到抗酸杆菌 +: 全视野发现3～9个++: 全视野发现10～99个+++: 每视野发现1～9个++++:每视野发现10个以上全视野发现1-2个时报告抗酸菌个数7.1.4 放线菌及奴卡菌涂片检查：将痰液用生理盐水反复洗涤数次，如含血液则加蒸馏水溶解红细胞，然后挑取黄色颗粒（硫磺颗粒）或不透明的着色斑点，置玻片上覆以盖玻片，轻轻挤压，置高倍镜下观察其结构，如见中央为交织的菌丝，其末端粗杆形呈放线状排列。然后揭去盖玻片，自然干后做革兰及抗酸染色镜检。如查见中央部分菌丝为革兰阳性，而四周放射的末梢菌丝为革兰阴性，抗酸染色为非结核性者，可报告：找到疑似放线菌。如查见革兰染色反应与放线菌相同，但抗酸染色为弱抗酸性（正常脱色时间红色完全退色，故脱色时间要短），可报告：找到疑似奴卡菌。7.1.5 厌氧菌涂片检查：涂片染色同一般细菌，镜检时注意有芽胞的革兰阳性杆菌，可能是梭状芽胞杆菌属。如见芽胞位菌体不膨大，排列呈竹节状，要注意炭疽芽胞杆菌、两端尖的革兰阳性杆菌，可能为梭杆菌及革兰阴性无芽胞杆菌；如痰有恶臭可能有拟杆菌，根据细菌的着色、形态、排列做出初步诊断。7.1.6 白喉棒状杆菌：查见革兰阳性棒状杆菌，排列不规则，用异染颗粒染色有明显异染颗粒，则可作出初步报告。7.1.7奋森螺旋体：革兰染色后见有淡红色疏螺旋体，有3～10个稀疏不规则的螺旋，呈波状，可做初步报告。7.1.8 麻风杆菌：疑似麻风病人的鼻粘膜涂片中可见细长、两端略尖的抗酸杆菌，集于细胞内或成束排列。7.2.培养检查7.2.1培养前处理(1) 痰的洗净：由于痰含有正常菌群，影响病原菌检出，采取以下方法减少正常菌群。将痰加入10-20ml无菌生理盐水的试管中，轻轻振荡5～10秒，将洗涤的盐水倒掉，以同样方法反复洗两次，最后将剩余的脓痰接种在培养基上或进行均质化后接种。(2) 痰的均质化：以SPUTOSAL痰消化液（购于英国OXOID公司）作痰液均质化。向痰内加等量痰消化液，振荡3-5分钟，使痰液均质化，而对细菌培养无影响。(3) 肺泡灌洗液:重要的是要进行定量或半定量培养。10ul灌洗液点种到适宜的培养基上，均匀划线布满整个平皿，24h、48h分别观察是否生长。生长阳性进行计数、涂片、分类鉴