1999分子生理学实习-佐藤直树研究室-东京大学.doc

2000年度　細胞生化学実験　2 （佐藤?太田） 2000年 11月27日　?　2001年 1月29日 埼玉大学理学部分子生物学科  日程 2000 / 11 / 27 全体の説明 2000 / 12 / 4、2001 / 1 / 15 葉緑体単離 2000 / 12 / 5、2001 / 1 / 16 DNAの単離 2000 / 12 / 11、2001 / 1 / 22 DNAの分析 2000 / 12 / 12、2000 / 1 / 23 まとめ この他に、蛍光顕微鏡による葉緑体核様体の観察をする。顕微鏡が１台しかないので、グループごとに日程を決めて、栽培と観察を行う。 実習内容 1.　葉緑体の単離） 2.　葉緑体DNAの単離 3.　細胞核DNAの単離（参考） 4.　DNAの制限酵素処理と電気泳動 細胞内の葉緑体DNAの蛍光顕微鏡による観察 この他に、DNAの分析に関しては、遺伝学実習のマニュアルも持参して参照すること。 注意事項 実習では、臭化エチジウム、DAPIなどの発ガン性が疑われる物質を利用する。また、超遠心機?遠心機は、操作を誤ると機械本体を破損し、場合によっては人身事故につながる可能性もある。シリンジの針、カミソリの刃なども用いるが、細心の注意を払って、くれぐれもけがをしないようにすること。 関連事項の説明 プラスチドとプラスチドDNA プラスチド（色素体、plastid）と総称されるオルガネラは、もともと未分化な細胞ではプロプラスチド（原色素体）とよばれる，小型で内膜系がほとんど発達していないオルガネラに由来する。分化したプラスチドは，緑葉では葉緑体(chloroplast)として光合成に，根ではアミロプラストとしてでんぷんの貯蔵に，さらにある種の花弁ではクロモプラストとして色素合成に，とそれぞれの機能に中心的な役割を果たし，植物細胞の分化?発達と密接に関連した分化?発達を示す。さらにプラスチドは，植物細胞における脂質合成?窒素代謝?硫黄代謝の中心であり，形態がどのように変化しようともプラスチド自体は，植物細胞には欠かせない必須のオルガネラである。以下では，植物に関する限り、プラスチドの代わりに葉緑体と呼んでいる場合も多いが、場合によって判断してもらいたい。 プラスチドには、独自のDNAがあり、プラスチドDNA（ptDNA）または葉緑体DNA（以下cpDNAと略す）と呼ばれている。プラスチドの様々な機能は、cpDNAにコードされてた遺伝子産物に依存している。cpDNAはタンパク質とともに高次の複合体を形成し、葉緑体核（色素体核、plastid nucleusまたは葉緑体核様体chloroplast nucleoid）として存在し、これがcpDNAの機能的な単位となっている。ここでは、特に断らない限り、核様体と表現している。核様体については次の項目で説明する。 　すでに「オルガネラの分子生物学」の講義で説明しているように、プラスチドDNAの構造は、十指に余る種の植物?藻類で決められており、共通していることは、環状の100?190 kbpのDNAであること、ほとんどのptDNAには逆位反復配列（inverted repeat）があることなどである。光合成能力を持たない寄生植物の場合をのぞき、ptDNAには光合成関連タンパク質の遺伝子が数多くコードされている。その他、全てのptDNAに共通して、rRNA (16S-23S-5S)、tRNA（ほぼ全種類）などのRNA遺伝子、リボゾームタンパク質をコードする遺伝子（半数ぐらい）、ATP合成酵素のサブユニットの一部をコードする遺伝子、RNAポリメラーゼの?????????’, ?’’サブユニットをコードする遺伝子などがある。これらのRNAポリメラーゼサブユニットは、細胞核にコードされたシグマ因子とともに、PEP（プラスチドコード型RNAポリメラーゼ）のホロ酵素を形成する。この他に細胞核にコードされ、葉緑体に輸送されるT7ファージタイプのRNAポリメラーゼがあり、NEPと呼ばれている。葉緑体の発達過程では、はじめにNEPが働いて、PEPの遺伝子を転写してPEPを作りだし、その後にはPEPにより光合成遺伝子が転写される。従って、遺伝子によっては、NEP用のプロモータとPEP用のプロモータを持つものがある。また、転写産物も複雑で、長い転写産物からプロセシングにより、モノシストロニックRNAがつくられる場合もあり、こうした過程が翻訳をどのように制御しているのかはまだ明らかではない。 葉緑体の機能は，葉緑体DNA (以下cpDNAと略す) にコードされた遺伝情報だけでなく，細胞核にコードされた遺伝子産物に依存している。cpDNAはタンパク質とともに高次の複合体を形成し，