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分子生物学方法 在评价废水生物处理过程中的作用 清华大学 王建龙 2004-05-26; 微生物在处理水、废水、污泥以及受污染场地的生物修复中得到了广泛的应用。但是，生物处理过程中经常出现一些故障，例如，活性污泥处理废水过程中的污泥膨胀，厌氧消化过程中的过度酸化现象等，使处理工艺难以发挥最佳功效。人们对这些过程中微生物种群的组成、各种微生物所起的作用以及它们之间的相互关系尚缺乏深刻的认识。 ; 传统的基于微生物培养和纯种分离的技术在研究微生物生态、描述微生物群落的结构和多样性时存在诸多局限性，主要表现为： （1）对微生物类群进行描述之前必须首先进行培养，然而自然生境中的微生物，其大部分种类至今为止是不可培养的。 （2）现有微生物分类标准具有主观性。即使某些新发现的微生物种可以被培养，但往往与现行的分类标准体系不相符，而已有的对各种微生物表型的描述也常常不能满足区分各种类群的需要。 ; 基于现代生物学的分子方法，为深入研究废水生物处理过程中各种微生物的作用，为深刻理解废水处理过程的本质、提高处理系统的性能以及进行工艺革新等提供了新的强有力的方法和手段，为我们了解这些处理系统中的微生物生态并对处理过程进行工程控制提供了可能。分子生物学方法的出现使我们有可能更好的理解现有的生物处理工艺（如活性污泥法、厌氧污泥消化）以及开发新的处理工艺。 ;利用分子生物学方法可以直接获得活性污泥中微生 物种群的基因信息，可以为我们提供传统的测量指标，如生化需氧量（BOD）、挥发性悬浮固体（VSS）等所不能反映的一些精确信息。分子生物学方法可以跟踪活性污泥中一些关键性的微生物，如丝状菌、氨氧化菌等。我们将介绍常用的分子生物学方法在废水生物处理微生物学研究中的一些成果及最新进展，包括微生物的原位检测和定量分析、废水处理系统中微生物的多样性、与污泥膨胀和产生泡沫有关的细菌以及脱氮除磷微生物等。; 分子生物学方法可以直接探询微生物种群中我们感兴趣微生物的基因信息，而这些信息是传统的分析方法不可能获得的。利用分??生物学方法可以省去对微生物的选择培养以及利用形态特征进行鉴定微生物存在的偏差。 本节主要内容 1.1 分子方法探询的基因目标 1.2 以rRNA为基因目标的优点 1.3 分子信息及其应用 ;与建立在某些表型特性基础上的细胞富集培养方法不同，分子方法直接针对微生物群落的基因信息，分子技术测定的是细胞DNA或RNA的碱基序列。 ? 分子方法以不同类型的DNA或RNA为目标，这取决于我们需要哪种信息。表1总结了检测目标以及每个目标能够提供的信息。;;复制;1.2 以rRNA为基因目标的优点 ;（1）生物细胞需要rRNA将遗传信息翻译成蛋白质，因此，rRNA存在于所有的生物细胞中； （2）生物细胞内含有大量的核糖体，因此，rRNA相对来说容易检测到； （3）由于rRNA被包埋于核糖体中，因而相对较为稳定； （4）细菌和古细菌的小亚单位rRNA，即通常所说的16S rRNA，大约含1600个碱基对，这1600个碱基对可以提供足够的进化信息，从中选择15-20个碱基对序列的寡核苷酸片段用作探针，可以检测和鉴定多种微生物； （5）从环境样品中分离出rRNA并用于微生物系统发育、种类鉴定、多态性及多样性研究的方法已全面建立。 利用rRNA序列研究微生物群落特征的方法总结如图2。 ;利用rRNA序列研究微生物群落特征的方法 ;1.3 分子信息及其应用 ;目前常用的分子方法有: 2.1核酸杂交 2.2变性梯度凝胶电泳 2.3限制性片段长度多态性 2.4 报告基因法;2.1 核酸分子杂交技术; 核酸杂交的主要步骤是核酸分子的变性和选择性退火。双链DNA或处于二级结构的RNA分子通过变性回复到它们原来的单链、线性形式，从而使它们处于能与互补的核苷酸链退火杂交的状态。 杂交实验中所用到的核酸探针通常以需要检测的核酸序列为基础，它们可以来自DNA、RNA、寡核苷酸或cDNA等。 ;核酸杂交以碱基配对原理为基础，利用寡核苷酸探针与靶细胞专一性结合进行生物分析。核酸杂交的基本实验步骤为：细胞固定、杂交（专一性和严格性依赖于杂交温度和时间、盐浓度、探针长度及其浓度）、洗脱（去除与靶细胞没有结合和非专一性结合的物质）和检测，如下图所示。;核酸杂交的步骤 ;核酸杂交试验并不要求探针与目标核酸序列之间百分之百地互补。有限数目的非互补碱基对的存在是可以接受的。互补的单链核苷酸分子经退火形成核酸双链分子的过程是可逆的。因此，可以通过改变反应的物理和化学环境（条件）从而增加核酸双链分子生成的速度、程度及其稳定性。影响两段互补核苷酸链杂交的因素包括：杂交和洗膜的温度、杂交时间、离子强度、甲酰胺浓度、碱基对之间非互补的程度以及探针分子和靶核酸序列的