临床免疫检验技术第七单元甲肝抗体（IgM）检测甲肝的测定.ppt

甲型肝炎病毒—IgM抗体检测 肝炎 ●目前已知:甲、乙、丙、丁、戊、已、庚及TTV型肝炎，在我国均有发生，其中尤以甲、乙、丙、戊4个型别的流行情况严重。 ●两类：经消化道传播：甲型、戊型 经血液传播：乙型、丙型、丁型 甲型肝炎 甲型肝炎（hepatitis A，HA，简称甲肝）是一种由甲型肝炎病毒（HAV）引起的急性肠道传染病。该病主要经粪-口途径传播，易发生食物型和水型爆发流行, 常呈季节性和周期性流行，主要感染对象为儿童。随着卫生条件的改善和疫苗的应用，甲肝流行特征发生了一些变化，如季节性和周期性逐渐消失，感染年龄后移。 常见症状 流感样症状 厌食 恶心 黄疸（眼部及皮肤呈黄色） 尿黄 腹痛 乏力 甲型肝炎病毒 HAV的电镜照片 （1973） 甲型肝炎病毒 属小RNA病毒科，直径27nm，无包膜 呈20面立体对称 外面为一独立外壳，内含一个单链RNA分子 甲型肝炎病毒 HAV的免疫性 HAV只存在单一的抗原抗体系统，即HAVAg和抗-HAV 无论显性感染还是隐性感染均能诱生出高效价抗-HAV 抗-HAVIgM阳性是甲肝的确诊依据 IgM型抗体在感染后仅持续存3-6个月, IgG型抗体则可存在多年 HAV的其他生物学特性 抵抗力 比肠道病毒更耐热，60℃1h不被灭活，100oC 5分钟可灭活 对乙醚、酸处理（pH 3）均有抵抗力 氯消毒(如次氯酸钠）、紫外线照射、福尔马林处理均可破坏其传染性 标本采集 采集前病人准备：受检者应空腹。 标本种类：血清或血浆。 标本要求：采集病人静脉血3ml（可用EDTA抗凝），室温放置不超过12小时。 标本储存 2-8°C保存不应超过1周， -20°C不应超过3个月， -70°C长期保存，应避免反复冻融。 标本拒收标准 污染 标本量不足 严重溶血或脂血标本不宜作此项检测 实验目的 了解酶免疫标记技术的原理、种类和用途 熟悉和掌握用捕获法酶联免疫吸附实验检测甲型肝炎病毒—IgM抗体的原理及实验方法 主要试剂: 酶标记的抗体或抗原 酶标物特点： 免疫学活性 酶对底物的催化活性 抗原抗体反应的特异性 + 酶高效催化反应的专一性 酶免疫技术的原理及特点 酶免疫技术 酶免疫组化 酶免疫测定 均 相 非均相 固相酶免疫测定 液相酶免疫测定 组织切片或其它标本中抗原的定位 液体标本中抗原或 抗体的定性和定量 底物显色 定性或定量的分析 原理 包被 反应 加入待测抗体或 抗原和酶标抗原 或抗体 洗涤 使结合在固相上 的抗原抗体复合物 与未结合的分离 1 2 3 4 ELISA 基本原理 实验原理 本试剂盒采用捕获法酶联免疫吸附实验原理。 以抗人IgM抗体（抗人μ链）作为固相抗体，当加入标本时，其中的IgM类抗体（特异的和非特异的）即可被固相抗体捕获，再加入特异抗原，当其与固相上捕获的IgM抗体结合后，加入酶标抗特异抗原的抗体，最后加入底物显色 捕获法原理 + - E E E E E 1、固相化抗人 　IgM 1、固相化抗人 　IgM 2、加待测物 特异性IgM与 非特异性IgM 和抗人IgM结合 3、加特异性 抗原，与特异 性抗体结合 4、加酶标抗体 与特异性抗原结 合，加底物显色 2、加待测物 只有非特异性IgM 和抗人IgM结合 3、加特异性抗 原，不能与非 特异性IgM结合 4、加酶标抗体 无抗原结合， 加底物不显色 实验材料 甲型肝炎病毒—IgM抗体检测试剂盒 实验方法 1. 平衡 将试剂盒取出，平衡至室温（18-25°C） 2. 配液 浓缩洗涤液和蒸馏水或去离子水按1：19稀释后使用。 3. 稀释样品 将待检样品用稀释后的洗液按1:1000的比例进行 稀释，混匀待用。 4.加样 将微孔条固定于支架，每板应设阴性对照3孔、阳性对照2孔、空白1孔。将稀释后的待测血清100?l，阴、阳性对照各100ul加于相应孔中。 实验方法 5. 温育 充分混匀，加上封板膜，置37℃温育30分钟。 6. 洗涤 弃去孔内液体，将稀释后的洗液注满各孔，静置30~60秒，弃去孔内洗液。重复洗6次后拍干。 7. 加连接抗原及酶标记物 空白对照孔不加任何液体，其余孔加入连接抗原50 ?l ；再加入酶标记物50 ?l 。 8. 温育 充分混匀，加上封板膜，置37℃温育30分钟。 实验方法 9. 洗涤 弃去孔内液体，将稀释后的洗液注满各孔，静置 30~60秒，弃去孔内洗液。重复洗6次后拍干。 1