生物化学实验知识讲解.ppt

六、 注意事项 各步骤操作应力求准确，尽量减少中途核酸的丢失 肝匀浆时，应在冰冷条件下进行，并尽快加入含0.0l mol/EDTA的 0.14mol/L氯化钠溶液，以抑制脱氧核糖核酸酶，防止DNA的分解以提高核酸得量。 氯仿中加入少量异戊醇能减少操作过程泡沫的产生，有助于分相，使离心后的上层水相，中层变性蛋白，下层有机溶剂相维持稳定。 DNA 粗品用氯仿-异戊醇除蛋白需重复几次，直至蛋白杂质完全除去。 在三相混合的离心管中，吸取上清溶液需小心，不要将氯仿溶液吸出。 加冷 95％乙醇后，用玻棒慢慢搅动（朝一个方向），DNA 会缠绕在玻棒上。 七、思考题 1.根据脱氧核酸在细胞内的分布、存在方式及其特性，提取过程中采取了什么相应的措施？ 2.若要快速简便地区分出RNA和DNA，应该采用什么颜色反应？为什么？ 实验六 脱氧核糖核酸定量测定 一、实验目的 1.掌握二苯胺法测定DNA含量的原理及操作方法。 二、实验原理 DNA分子中的脱氧核糖基，在酸性溶液中变成ω-羟基-γ-酮基戊醛， 与二苯胺试剂作用生成蓝色化合物（λmax＝595nm）。 在 DNA浓度为40～400μg/ml 范围内，吸光度与DNA浓度成 正比，可用比色法测定。 在反应液中加入少量乙醛，可提高灵敏度。 三、实验材料、仪器与试剂 标准DNA：小牛胸腺DNA钠盐用0.01M NaOH溶解（20mg/100ml） 样品待测液：DNA干燥品用0.01M NaOH溶解（10mg/100ml） 二苯胺试剂：将1g二苯胺溶于100ml冰醋酸中，再加入10mL过氯酸（置冰箱中可保存6个月） 。临用前，加入1ml 1.0%乙醛溶液。试剂应为无色 四、实验操作 1.DNA标准曲线的制作 2.样品测定 标 准 管 样品管 ml 0 1 2 3 4 5 6 7 DNA标准液 0 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0 2.0 2.0 蒸馏水 2.0 1.6 1.2 0.8 0.4 0 0 0 二苯胺试剂 4.0 4.0 混匀，60℃保温1h后，冷到室温 DNA含量μg 0 80 160 240 320 400 记录 A595 0 五、 结果处理 1.绘制标准曲线，作出回归直线方程， 2.用回归直线方程计算样品待测液中DNA浓度， 3.计算样品中DNA百分含量。 六、 注意事项 二苯胺的纯度很重要，如不纯，需在 70％乙醇中重结晶 2 次。加入乙醛之前，试剂应为无色。试剂临用前配制，效果最好。 样品 DNA 出现不全溶时，可适当加一些碱如氨水或稀 NaOH。 其他糖（脱氧木糖、阿拉伯糖）及糖的衍生物、芳香醛、羟基醛和蛋白质等，对此反应干扰， 测定前尽量除去。 核糖等一般无此反应。 七、思考题 1.二苯胺试剂与DNA的什么部分起作用？ 2.写出ω-羟基-γ-酮基戊醛的结构式。 3.该法测定DNA的干扰有什么？ 4. 快速鉴别RNA和DNA的方法是什么? 实验七 发酵过程中无机磷利用 一、实验目的 1.了解发酵过程中无机磷的作用及磷酸化检查方法。 2.掌握定磷法的原理及实验技术。 二、实验原理 酵母能够发酵糖产生乙醇和 CO2,这一现象的生理机理主要涉及到糖的氧化磷酸化过程。在此过程中，糖利用反应体系中的无机磷，磷酸化成不同的有机代谢中间产物（磷酸酯），使酵母发酵体系中无机磷的含量不断减少。 无机磷酸可以与钼酸作用生成磷钼酸络合物，进而被α-1，2，4-氨基萘粉璜酸钠还原成钼蓝化合物，该化合物颜色的深浅与磷酸的量成正比，由此可对无机磷进行定量。 本实验通过定时定量测定反应体系中的无机磷，来观察发酵过程中酵母对无机磷的应用情况。 三、实验材料、仪器与试剂 1.仪器：恒温水浴国、752型分光光度计、刻度离心管、研钵、吸量管、试管和试管架。 2.原料：新鲜啤酒酵母或活性干酵母。 3.试剂: ①蔗糖 ②磷酸盐溶液：准确称取磷酸氢二钠（Na2HPO4·H2O）6g 和磷酸二氢钾（KH2PO4·H2O）2g 溶于水中，用水定容至1000ml，放冰箱中备用。 ③标准磷酸盐溶液（含磷 25μg/ml）：先将磷酸二氢钾在110℃烘干2h，在干燥器中冷却后，准确称取 0.1098g 用水溶解并定容至1000ml，放冰箱中备用。 ④ 5%三氯乙酸溶液。 ⑤硫酸-钼酸铵溶液：2.5mol/L 硫酸和 2.5% 钼酸铵溶液等体积混合。 ⑥α-1,2,4-氨基萘酚磺酸钠溶液：称取 0.25g α-1,2,4-氨基萘磺酸、15g 亚硫酸氢钠和 0.5g 亚硫酸钠，用水溶液并定容至100ml。临时用，加4倍水混匀。 四、实验操作 1．绘制标准曲线 取6支试管，按下表操作： 注意：各管加入α-1，2，4-氨基萘磺酸钠溶液时，应加每一管，立即混匀。 以无机磷量（μg）为横