蛋白质与蛋白质、DNA相互作用研究技术方法加实例.pptVIP

; 蛋白质与蛋白质的相互作用的研究方法;酵母双杂交系统 ;1.1 酵母双杂交技术的原理 酵母双杂交系统由Fields和Song等首先在研究真核基因转录调控中建立。他的产生是基于对酵母转录因子GAL4性质的研究. 基因转录不仅需要有特定的DNA顺式序列结构，而且也需要有反式转录激活因子的参与。 转录激活因子往往由两个或两个以上相互独立的结构域构成,其中有DNA结合结构域(DNA binding domain, DB)和转录激活结构域(activation domain, AD), 它们都是转录激活因子发挥功能所必需的。 单独的BD或AD都不能激活基因转录，但不同转录激活因子的DB和AD形成的杂合蛋白仍然具有正常的激活转录的功能。; 如果要研究两个蛋白之间有无相互作用，可以把这两 个蛋白分别与DB和AD形成的融合蛋白。 与DB 融合的蛋白称为“诱饵”(bait)， 与AD融合的蛋白称为“猎物”(prey)。 如果这两个蛋白能发生相互作用, 这两个融合蛋白上的 DB和AD就能重新形成有活性的转录激活因子, 从而激活 报告基因(reporter gene)的转录与表达。 通过检测报告基因的表达产物, 可判别“诱饵”和“猎物” 这两个蛋白质之间是否存在相互作用。 ;1.1 酵母双杂交技术的原理;;1.2 酵母双杂交操作主要流程 1. 分别构建BD和AD融合蛋白载体 2. 分别将重组载体转化酵母菌细胞 3. 对酵母转化子进行自激活检测 4. 将重组载体共转化酵母菌细胞 5. 检测报告基因表达产物 6. 分析酵母双杂交实验结果;Yeast two hybrid assay. Direct yeast two hybrid experiment with the constructs FAM124B-1,3-pGADT7 (full length transcript variant 1) and CHD7-CR1-3-pGBKT7 (amino acids 1591-2181, demonstrating no direct interaction between FAM124B transcript variant 1 and the CHD7 part, while (B) Direct yeast two hybrid experiment with the constructs FAM124B-1,3-pGADT7 (full length transcript variant 1) and CHD8-pGBKT7 (amino acids 1789–2302, shows a direct interaction. The same experiments were performed for FAM124B transcript variant 2. (C) Direct yeast two hybrid experiment with the constructs FAM124B-1,2-pGADT7 (full length transcript variant 2) and CHD7-CR1-3-pGBKT7 (amino acids 1591-2181, (D) Direct yeast two hybrid experiment with the constructs FAM124B-1,2-pGADT7 (full length transcript variant 2) and CHD8-pGBKT7 (amino acids 1789–2302, FAM124B transcript variant 2 interacts directly with the CHD8 part, while no direct interaction with the CHD7 part could be observed.; 酵母双杂交系统是一种在酵母细胞内分析蛋白质相互作用的技术。主要有二类载体: a 含DNA -binding domain的载体; b 含Transcription-activating domain的载体。另外还需要特殊的酵母菌株如GAL4缺陷型。 ;1.4 酵母双杂交技术的优点： 是一种细胞内蛋白质相互作用研究技术，比体外的蛋白质相互作用技术更接近生物体内的真实情况。 基于基因重组技术和分子遗传学的原理，更便于观察和检测实验结果。 酵母菌是一种低等真核微生物，能反映真核生物的基本生命现象和规律。 4. 酵母菌