vmip-ⅱn端重组肽的表达纯化及活性鉴定-生物通.pdf

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１０，３０（９）：８０８６ 檪檪檪檪檪檪檪檪殏 檪 殏 檪 檪 研究简报 殏 檪 殏檪檪檪檪檪檪檪檪 ｖＭＩＰ Ｎ端重组肽的表达纯化及活性鉴定 Ⅱ １ ２ ２ １ 杨清玲 　杨志峰 　高艳军 　陈昌杰 （１蚌埠医学院生化与分子生物学教研室　蚌埠　２３３０３０　２蚌埠医学院临床检验诊断学实验中心　蚌埠　２３３０３０） 摘要　病毒巨噬细胞炎症蛋白 （ｖｉｒａｌｍａｃｒｏｐｈａｇｅｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙｐｒｏｔｅｉｎ ，ｖＭＩＰ ）由卡波西肉 Ⅱ Ⅱ Ⅱ 瘤疱疹病毒编码，前期研究证明了ｖＭＩＰＩＩＮ端２１肽（ＮＴ２１ＭＰ）选择性的阻断趋化因子ＣＸＣＲ４， 从而抑制乳腺癌细胞趋化的活性。通过化学合成法获得编码 ｖＭＩＰ Ｎ末端的基因序列，与 Ⅱ ｐＧＥＸＫＧ（克隆位点的Ｎ端有谷胱甘肽转移酶ＧＳＴ标签序列）连接构建原核表达载体，重组质粒 在大肠杆菌Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）中获得表达，免疫印迹显示重组蛋白ＧＳＴＮＴ２１ＭＰ主要在细菌裂 解液上清中表达，可溶性部分经亲和层析、超滤、快速蛋白液相色谱 （ｆａｓｔｐｒｏｔｅｉｎｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，ＦＰＬＣ）纯化获得高纯度的ＧＳＴＮＴ２１ＭＰ蛋白。利用Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ趋化试验测定ＧＳＴ ＮＴ２１ＭＰ的活性。结果显示，重组蛋白ＧＳＴＮＴ２１ＭＰ能够抑制乳腺癌细胞ＳＫＢＲ３的趋化活性， 可作为治疗乳腺癌转移的潜在性靶向药物。 关键词　ｖＭＩＰ　ＣＸＣＲ４　ＳＤＦ１　纯化 Ⅱ 中图分类号　Ｑ８１６ 　　ｖＭＩＰ 是由人疱疹病毒８型Ｋ４基因编码的一种 Ⅱ １　材料与方法 分子质量为１０．５ｋＤａ的小分子蛋白质，与人ＣＣ类趋化 因子具有同源性，是一种广谱的趋化因子受体拮抗 １．１　材料 ［１］ 剂 。研究证实ｖＭＩＰ 与趋化因子受体ＣＸＣＲ４结合 　　菌株Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３），质粒载体ＰＧＥＸＫＧ以及 Ⅱ ［２］ 的活性位点主要位于ｖＭＩＰ Ｎ末端的非结构域 。 乳腺癌细胞株ＳＫＢＲ３由本实验室保存；寡核苷酸退火 Ⅱ ［３４］ ＳＤＦ１／ＣＸＣＲ４轴与肿瘤转移密切相关 。我们前期 缓冲液、ＢＣＡ蛋白浓度测定试剂盒均购自碧云天生物技 对ｖＭＩＰ 序列以及分子结构进行了分析，寻找Ｎ端与 术研究所；质粒提取试剂盒、限制性内切核酸酶ＢａｍＨ和 Ⅱ Ⅰ ＣＸＣＲ４结合相关的高度保守区，通过固相合成技术制 Ｈｉｎｄ 、Ｔ４ＤＮＡ连接酶、琼脂糖凝胶ＤＮＡ回收纯化试剂 Ⅲ 备来源于ｖＭＩＰ 、具有特异结合 ＣＸＣＲ４受体的活性 盒均购自大连宝生物工程有限公司；氨苄青霉素（ＡＭＰ）、 Ⅱ 多肽，在活性测定、动物实验中均表现出高效的ＣＸＣＲ４ ＩＰＴＧ、ＡＭＤ３１００购自Ｓｉｇｍａ公司；蛋白质分子量标准购 ［５７］ 抑制活性 。为降低成本，为临床药物开发奠定基